Imágenes de autofluorescencia para evaluar la fisiología de las algas rojas
Summary
El presente protocolo describe imágenes de autofluorescencia paso a paso y la evaluación de los cambios de ficobiliproteína en algas rojas basadas en análisis espectral. Este es un método no destructivo y sin etiquetas para evaluar la adaptación celular a hábitats extremos, cuando solo hay material escaso disponible y las células crecen lentamente, o no crecen en absoluto, en condiciones de laboratorio.
Abstract
Las algas rojas (Rhodophyta) contienen ficobiliproteínas y colonizan hábitats con poca luz, sin embargo, algunas (por ejemplo, algunas especies de Chroothece ) también pueden desarrollarse a pleno sol. La mayoría de las rodófitas son rojas, sin embargo, algunas pueden aparecer azuladas, dependiendo de la proporción de biliproteínas azules y rojas (ficocianina y ficoeritrina). Diferentes ficobiliproteínas pueden capturar la luz en diversas longitudes de onda y transmitirla a la clorofila a, lo que hace posible la fotosíntesis en condiciones de luz muy diferentes. Estos pigmentos responden a los cambios de hábitat en la luz, y su autofluorescencia puede ayudar a estudiar los procesos biológicos. Utilizando Chroothece mobilis como organismo modelo y el modo de escaneo lambda espectral en un microscopio confocal, se estudió la adaptación de pigmentos fotosintéticos a diferentes luces monocromáticas a nivel celular para adivinar las condiciones óptimas de crecimiento de la especie. Los resultados mostraron que, incluso cuando la cepa estudiada se aisló de una cueva, se adaptó a intensidades de luz tenue y media. El método presentado es especialmente útil para estudiar organismos fotosintéticos que no crecen o crecen muy lentamente en condiciones de laboratorio, que suele ser el caso de aquellos que viven en hábitats extremos.
Introduction
Las algas rojas, como el género Chroothece, pueden crecer en hábitats extremos, donde con frecuencia tienen que hacer frente a cambios ambientales marcados1. Las inundaciones y sequías son frecuentes en las regiones semiáridas donde se puede encontrar este género, y algunas especies han sido reportadas en arroyos, acantilados, cuevas o incluso aguas termales2. Sin embargo, la mayoría de las veces, las variables biológicas, como la competencia o el pastoreo, relegan a las especies a condiciones no óptimas para su crecimiento. Como estos organismos a menudo son difíciles de cultivar y no crecen o crecen muy lentamente en condiciones de laboratorio, una limitación importante es el tamaño de la muestra disponible. Por lo tanto, es muy importante seguir métodos no destructivos o métodos que impliquen una manipulación mínima de la muestra 3,4.
Las habilidades fisiológicas necesarias para sobrevivir en estos ambientes hostiles pueden ser monitoreadas siguiendo los cambios en sus sistemas fotosintéticos. Los mecanismos metabólicos, la eficiencia fotosintética y la sensibilidad a la luz o a las condiciones de cultivo pueden ser revelados por los perfiles de emisión de fluorescencia de pigmentos, debido a cambios precisos en su transferencia de energía o atrapamiento 5,6,7,8.
La autofluorescencia de compuestos celulares puede ser utilizada como marcador para el citodiagnóstico o como indicador natural del estado celular o metabolismo en respuesta a señales externas e internas a través de cambios en la emisión9. También se puede utilizar para discriminar taxonómicamente diferentes grupos de organismos fotosintéticos10. Dependiendo de la posición filogenética de los microorganismos fototróficos, se pueden encontrar diferentes características de fluorescencia in vivo. Por lo tanto, se ha intentado en varias ocasiones una identificación taxonómica basada en las características in vivo de la fluorescencia fototrófica (incluyendo espectros de absorción y emisión de fluorescencia)11,12. Debido a la diversidad de pigmentos accesorios entre los taxones de fitoplancton, las diferencias en las longitudes de onda en las que se estimula la fluorescencia de la clorofila a (Chl a), o las diferencias en los espectros de emisión, pueden usarse para inferir la taxonomía13. Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia in vivo de estos especímenes dependen no sólo de los filos de algas, sino también de la adaptación del fotosistema14. La eficiencia de la transferencia de energía a Chl a, o la relación de Chl a a pigmentos accesorios, y el contenido de pigmento celular son sensibles a las condiciones de crecimiento5.
Las algas rojas, particularmente Chroothece, tienen varios pigmentos fluorescentes accesorios: ficobiliproteínas y carotenoides; Los primeros se concentran en ficobilisomas unidos a los tilacoides de los cloroplastos. Las ficobiliproteínas (ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina) pueden capturar la luz en diferentes longitudes de onda y transmitirla a Chl a, lo que hace posible la fotosíntesis en condiciones de luz y cultivo muy diferentes15. Por ejemplo, las especies de Chroothece pueden crecer dentro de cuevas o casi emerger en arroyos calcáreos ligeramente salinos2.
Las luces monocromáticas afectan el crecimiento y la composición pigmentaria de los organismos fotosintéticos, y se han estudiado para prevenir o controlar el crecimiento de organismos fotosintéticos en cuevas. Mulec et al. demostraron que la iluminación enriquecida con rojo promueve el crecimiento de cianobacterias, algas y plantas16. Estudios previos también han reportado que la luz verde afecta la composición pigmentaria de las cianobacterias17, mientras que otros han revelado que la luz verde impide el crecimiento de la mayoría de los organismos fotosintéticos y algunas cianobacterias exhiben una reducción en los tilacoides y una intensidad de fluorescencia media más débil18.
Para comprender la capacidad de Chroothece como organismo modelo para superar condiciones difíciles, las células cultivadas han sido expuestas a intensidades de luz crecientes y luz monocromática (verde o roja)15, para ver cómo hace frente a las condiciones oscuras de las cuevas (donde predomina la luz roja). El protocolo aquí presentado reproduce el efecto de las variables antes mencionadas sobre las ficobiliproteínas de Chroothece a nivel celular utilizando su propia autofluorescencia.
Hoy en día, la fluorescencia se utiliza comúnmente como una herramienta para estudiar las respuestas fisiológicas de plantas vasculares, microalgas, macroalgas y cianobacterias13,14,16. La microscopía de fluorescencia confocal espectral es una excelente herramienta para estudios in vivo para evaluar la fisiología de las muestras fotosintéticas a nivel unicelular 10,17,18,19,20, evitando problemas asociados con la baja tasa de crecimiento en el laboratorio y las dificultades para obtener suficiente biomasa para los métodos de extracción y bioquímicos asociados8 . Una vez que las células se tratan bajo diferentes condiciones de cultivo durante 2 semanas, el perfil de exploración lambda se puede medir in vivo. Aunque hay varias publicaciones en las que se han utilizado diferentes longitudes de onda de excitación por imagen confocal 3,4,10,17, la mayoría de las ficobiliproteínas y Chl a se pueden detectar utilizando una línea de excitación de longitud de onda de 561 nm, y la emisión detectada varía de 570 a 760 nm de longitud de onda. Estos criterios se han basado en un análisis previamente realizado10 con pigmentos puros comerciales (Tabla 1) mediante imagen confocal y los resultados obtenidos en diferentes especies de algas20,21,22.
| Pigmentos | λflmáx. (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11,2 ± 0,2 | 1,8 ± 0,05 | 2,0 ± 0,08 | 12,2 ± 0,7 | 6,0 ± 0,3 | 4.2 ± 0,16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5,9 ± 0,6 | 5,9 ± 0,16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100,0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1,5 ± 0,01 | 3,7 ± 0,04 | 26,7 ± 0,5 | 8,7 ± 0,16 | 11,1 ± 0,16 | 11,3 ± 0,2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1,0 ± 0,01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2,0 ± 0,08 | 2,0 ± 0,04 | 3.3 ± 0.16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15,1 ± 1,5 | 9,6 ± 0,98 | 1,0 ± 0,04 | 1.2 ± 0.08 | 5,9 ± 0,7 | 4.1 ± 0.5 | 23,2 ± 3,5 | 91,4 ± 2,3 |
Tabla 1: La información de pigmento puro utilizada para ejecutar el análisis de escaneo lambda. Esta tabla muestra los picos de emisión y los hombros / máximos de banda de fluorescencia de diferentes fluorocromos / pigmentos por espectrofotometría de imagen confocal para todas las longitudes de onda de excitación, y el porcentaje de emisión de luz por pigmentos / fluorocromos. Los valores se calcularon mediante la fórmula: = MFI*100/255. Cada valor es la media ± SE (media ± error estándar de la media). Se utilizaron pigmentos puros para calibrar el microscopio láser de barrido confocal de la siguiente manera 1,2,10. La clorofila a se obtuvo de Spinacia oleracea, R-ficoeritrina (R-PE) de Porphyra tenera y C-ficocianina (C-PE) de Spirulina sp. Todas las especies fueron disueltas en agua destilada filtrada. La aloficocianina-XL (APC-XL) se obtuvo de Mastigocladus laminosus, que se disolvió en sulfato de amonio (60%) y fosfato de potasio (pH = 7) para alcanzar una concentración de 38 mM. Las exploraciones se realizaron con 400 μL de cada solución pigmentaria (concentración de 1 mg/ml) utilizando una cámara inferior de vidrio cubierta de 8 pocillos.
El estudio de una sola longitud de onda de excitación es una primera aproximación bastante útil. En este caso, sin embargo, es necesario dilucidar la contribución relativa de los diferentes complejos en la señal de fluorescencia, lo que se recomienda para realizar una relación de fluorescencia o análisis de espectro a varias longitudes de onda, entre otros métodos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algunas algas rojas unicelulares o coloniales, como Chroothece, crecen lentamente in vitro, pero contienen múltiples compuestos autofluorescentes que pueden analizarse mediante análisis espectral bajo un microscopio confocal, donde se pueden detectar diferencias en los picos de emisión de pigmentos. La microscopía de fluorescencia confocal espectral nos ha permitido realizar estudios in vivo para evaluar la adaptación o aclimatación de organismos fotosintéticos 8,10,17,18,19,20.<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación se ha realizado en el marco de los proyectos TIN2015-68454-R y 20961/PI/18, financiados por el Ministerio de Economía y Competitividad y la Fundación Séneca de la Región de Murcia. Irene Hernández Martínez y Francisco Javier Ibáñez López de la Sección de Apoyo Estadístico del Área Científica y de Investigación de la Universidad de Murcia (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Figura 1 ) se dibujaron utilizando imágenes de Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier está bajo una licencia Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
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