Beurteilung der mutmaßlichen Antikryptokokken-Eigenschaften von rohen und geklärten Extrakten aus Mollusken
Summary
Der humane Pilzpathogen Cryptococcus neoformans produziert eine Vielzahl von Virulenzfaktoren (z.B. Peptidasen), um sein Überleben im Wirt zu fördern. Umweltnischen stellen eine vielversprechende Quelle für neuartige natürliche Peptidase-Inhibitoren dar. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Extrakten aus Mollusken und die Bewertung ihrer Wirkung auf die Produktion von Pilzvirulenzfaktoren.
Abstract
Cryptococcus neoformans ist ein verkapselter humaner Pilzerreger mit einer globalen Verbreitung, der vor allem immungeschwächte Individuen infiziert. Der weit verbreitete Einsatz von Antimykotika im klinischen Umfeld, ihre Verwendung in der Landwirtschaft und die Stammhybridisierung haben zu einer verstärkten Entwicklung der Resistenz geführt. Diese steigende Resistenzrate gegen Antimykotika ist ein wachsendes Problem unter Klinikern und Wissenschaftlern weltweit, und es besteht eine erhöhte Dringlichkeit, neuartige antimykotische Therapien zu entwickeln. Zum Beispiel produziert C. neoformans mehrere Virulenzfaktoren, einschließlich intra- und extrazellulärer Enzyme (z. B. Peptidasen), die beim Gewebeabbau, der zellulären Regulation und der Nährstoffaufnahme eine Rolle spielen. Die Störung einer solchen Peptidaseaktivität durch Inhibitoren stört das Wachstum und die Vermehrung von Pilzen, was darauf hindeutet, dass dies eine wichtige Strategie zur Bekämpfung des Erregers sein könnte. Wichtig ist, dass wirbellose Tiere wie Mollusken Peptidase-Inhibitoren mit biomedizinischen Anwendungen und antimikrobieller Aktivität produzieren, aber sie sind in Bezug auf ihren Einsatz gegen Pilzpathogene noch wenig erforscht. In diesem Protokoll wurde eine globale Extraktion aus Mollusken durchgeführt, um potenzielle Peptidase-Inhibitoren in rohen und geklärten Extrakten zu isolieren, und ihre Auswirkungen gegen klassische Kryptokokken-Virulenzfaktoren wurden bewertet. Diese Methode unterstützt die Priorisierung von Mollusken mit antimykotischen Eigenschaften und bietet Möglichkeiten für die Entdeckung von Antivirulenzmitteln, indem sie die natürlichen Inhibitoren von Mollusken nutzt.
Introduction
Cryptococcus neoformans ist ein humaner Pilzerreger, der bei immungeschwächten Wirten, wie z. B. Personen mit HIV/AIDS1, schwere Erkrankungen hervorruft und zu etwa 19 % der AIDS-bedingten Todesfälle führt2. Der Pilz ist anfällig für mehrere Klassen von Antimykotika, einschließlich Azolen, Polyenen und Flucytosin, die unter Verwendung unterschiedlicher Mechanismen eine fungizide und fungistatische Aktivität ausüben 3,4. Der umfangreiche Einsatz von Antimykotika in klinischen und landwirtschaftlichen Umgebungen in Kombination mit der Stammhybridisierung hat jedoch die Resistenzentwicklung bei mehreren Pilzarten, einschließlich C. neoformans5, verstärkt.
Um die Herausforderungen der antimykotischen Resistenz zu überwinden und die Prävalenz von Pilzinfektionen auf globaler Ebene zu reduzieren, besteht ein vielversprechender Ansatz darin, die Virulenzfaktoren von Cryptococcus spp. (z. B. Temperaturanpassungsfähigkeit, Polysaccharidkapsel, Melanin und extrazelluläre Enzyme) als potenzielle therapeutische Ziele zu nutzen 4,6 . Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile, da diese Virulenzfaktoren in der Literatur gut charakterisiert sind, und das Targeting dieser Faktoren könnte möglicherweise die Raten der antimykotischen Resistenz reduzieren, indem ein schwächerer Selektionsdruck durch Beeinträchtigung der Virulenz ausgeübt wird, anstatt auf das Zellwachstum abzuzielen6. In diesem Zusammenhang wurde in zahlreichen Studien die Möglichkeit untersucht, extrazelluläre Enzyme (z. B. Proteasen, Peptidasen) gezielt einzusetzen, um die Virulenz von Cryptococcus spp.7,8,9 zu reduzieren oder zu hemmen.
Organismen wie Wirbellose und Pflanzen besitzen kein adaptives Immunsystem, um sich vor Krankheitserregern zu schützen. Sie sind jedoch auf ein starkes angeborenes Immunsystem mit einer immensen Anzahl chemischer Verbindungen angewiesen, um mit Mikroorganismen und Raubtieren fertig zu werden10. Zu diesen Molekülen gehören Peptidase-Inhibitoren, die in vielen biologischen Systemen eine wichtige Rolle spielen, einschließlich der zellulären Prozesse der Immunität von Wirbellosen, wie der Gerinnung der Hämolymphe, der Synthese von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden und dem Schutz von Wirten durch direkte Inaktivierung der Proteasen von Krankheitserregern11. So besitzen Peptidase-Inhibitoren von Wirbellosen wie Mollusken potenzielle biomedizinische Anwendungen, aber viele bleiben uncharakterisiert10,12,13. In diesem Zusammenhang gibt es in Ontario etwa 34 Arten von Landmollusken und in Kanada 180 Süßwassermollusken14. Ihre eingehende Profilierung und Charakterisierung ist jedoch noch begrenzt15. Diese Organismen bieten die Möglichkeit, neue Verbindungen mit potenzieller antimykotischer Aktivitätzu identifizieren 10.
In diesem Protokoll werden Methoden zur Isolierung und Klärung von Extrakten aus wirbellosen Tieren (z. B. Mollusken) (Abbildung 1) beschrieben, gefolgt von der Messung der mutmaßlichen Peptidase-hemmenden Aktivität. Die antimykotischen Eigenschaften dieser Extrakte werden dann bewertet, indem ihr Einfluss auf die Virulenzfaktorproduktion von C. neoformans unter Verwendung phänotypischer Assays gemessen wird (Abbildung 2). Es ist wichtig zu beachten, dass Unterschiede in den antimykotischen Eigenschaften zwischen rohen und geklärten Extrakten auf mikrobielle Faktoren (z. B. sekundäre Metaboliten oder vom Wirtsmikrobiom produzierte Toxine) der Molluske hinweisen können, die experimentelle Beobachtungen beeinflussen können. Solche Ergebnisse unterstützen die Notwendigkeit, dass in diesem Protokoll sowohl rohe als auch geklärte Extrakte unabhängig voneinander bewertet werden, um die Wirkungsweisen zu entschlüsseln. Darüber hinaus ist der Extraktionsprozess unvoreingenommen und kann den Nachweis antimikrobieller Eigenschaften gegen eine Vielzahl von Pilz- und Bakterienpathogenen ermöglichen. Daher bietet dieses Protokoll einen Ausgangspunkt für die Priorisierung von Molluskenarten mit antimykotischen Eigenschaften gegen C. neoformans und die Möglichkeit, die Zusammenhänge zwischen enzymatischer Aktivität und Virulenzfaktorproduktion durch mutmaßliche Hemmmechanismen zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Extraktionsprotokoll beschreibt die Isolierung von Verbindungen aus Mollusken, die in Ontario, Kanada, gesammelt wurden, und demonstriert eine neuartige Untersuchung der Verwendung von Molluskenextrakten gegen den menschlichen Pilzpathogen C. neoformans. Dieses Protokoll ergänzt eine wachsende Zahl von Forschungsarbeiten, die die Peptidase-Inhibitor-Aktivität von Wirbellosen untersuchen13. Während der Extraktion waren einige Extraktproben schwer zu filtern und zu …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitgliedern des Geddes-McAlister Lab für ihre wertvolle Unterstützung während dieser Untersuchung und ihr Feedback zu den Manuskripten. Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung durch das Ontario Graduate Scholarship und den International Graduate Research Award – University of Guelph an D. G.-G und durch die Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) und den Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award für J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
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