Yumuşakçalardan Ham ve Berraklaştırılmış Özlerin Tahmini Antikriptokok Özelliklerinin Değerlendirilmesi
Summary
İnsan mantar patojeni Cryptococcus neoformans , konakçı içinde hayatta kalmasını teşvik etmek için çeşitli virülans faktörleri (örneğin, peptidazlar) üretir. Çevresel nişler, yeni doğal peptidaz inhibitörlerinin umut verici bir kaynağını temsil etmektedir. Bu protokol, yumuşakçalardan ekstraktların hazırlanmasını ve mantar virülans faktörü üretimi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini özetlemektedir.
Abstract
Cryptococcus neoformans , öncelikle bağışıklık sistemi baskılanmış bireyleri enfekte eden küresel bir dağılıma sahip kapsüllenmiş bir insan mantar patojenidir. Antifungallerin klinik ortamlarda yaygın kullanımı, tarımda kullanımı ve suş hibridizasyonu, direncin evriminin artmasına neden olmuştur. Antifungallere karşı bu artan direnç oranı, dünya çapında klinisyenler ve bilim adamları arasında artan bir endişe kaynağıdır ve yeni antifungal tedaviler geliştirmek için artan bir aciliyet vardır. Örneğin, C. neoformans , doku bozulması, hücresel düzenleme ve besin ediniminde rol oynayan hücre içi ve hücre dışı enzimler (örneğin, peptidazlar) dahil olmak üzere çeşitli virülans faktörleri üretir. Bu tür peptidaz aktivitesinin inhibitörler tarafından bozulması, mantar büyümesini ve proliferasyonunu bozar, bu da bunun patojenle mücadelede önemli bir strateji olabileceğini düşündürmektedir. Önemli olarak, yumuşakçalar gibi omurgasızlar, biyomedikal uygulamalar ve anti-mikrobiyal aktivite ile peptidaz inhibitörleri üretirler, ancak mantar patojenlerine karşı kullanımları açısından yeterince araştırılmamışlardır. Bu protokolde, ham ve berraklaştırılmış ekstraktlarda potansiyel peptidaz inhibitörlerini izole etmek için yumuşakçalardan global bir ekstraksiyon gerçekleştirilmiş ve klasik kriptokokal virülans faktörlerine karşı etkileri değerlendirilmiştir. Bu yöntem, yumuşakçaların antifungal özelliklere sahip önceliklendirilmesini destekler ve yumuşakçalarda bulunan doğal inhibitörlerden yararlanarak anti-virülans ajanların keşfi için fırsatlar sağlar.
Introduction
Cryptococcus neoformans, HIV / AIDS1 ile yaşayan bireyler gibi bağışıklık sistemi baskılanmış konakçılarda ciddi hastalık üreten ve AIDS’e bağlı ölümlerin yaklaşık% 19’una yol açan bir insan mantar patojenidir2. Mantar, farklı mekanizmalar kullanarak mantar öldürücü ve fungistatik aktivite gösteren azoller, polienler ve flusitozin dahil olmak üzere çeşitli antifungal sınıflarına duyarlıdır 3,4. Bununla birlikte, antifungallerin klinik ve tarımsal ortamlarda yaygın kullanımı, suş hibridizasyonu ile birleştiğinde, C. neoformans5 de dahil olmak üzere birçok mantar türünde direncin evrimini arttırmıştır.
Antifungal direncin zorluklarının üstesinden gelmek ve küresel ölçekte mantar enfeksiyonlarının prevalansını azaltmak için, umut verici bir yaklaşım, Cryptococcus spp.’nin virülans faktörlerini (örneğin, sıcaklık adaptasyonu, polisakkarit kapsül, melanin ve hücre dışı enzimler) potansiyel terapötik hedefler olarak kullanmaktır 4,6 . Bu virülans faktörleri literatürde iyi karakterize edildiğinden ve bu faktörlerin hedeflenmesi, hücre büyümesini hedeflemek yerine virülansı bozarak daha zayıf bir seçici basınç uygulayarak antifungal direnç oranlarını potansiyel olarak azaltabileceğinden bu yaklaşımın birçok avantajı vardır6. Bu bağlamda, çok sayıda çalışma, Cryptococcus spp.7,8,9’un virülansını azaltmak veya inhibe etmek için hücre dışı enzimleri (örneğin, proteazlar, peptidazlar) hedefleme olasılığını değerlendirmiştir.
Omurgasızlar ve bitkiler gibi organizmalar, kendilerini patojenlerden korumak için uyarlanabilir bir bağışıklık sistemine sahip değildir. Bununla birlikte, mikroorganizmalar ve avcılarla başa çıkmak için çok çeşitli kimyasal bileşiklere sahip güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık sistemine güvenirler10. Bu moleküller, hemolenfin pıhtılaşması, sitokinlerin ve antimikrobiyal peptitlerin sentezi ve patojenlerin proteazlarını doğrudan inaktive ederek konakçıların korunması gibi omurgasız bağışıklığının hücresel süreçleri de dahil olmak üzere birçok biyolojik sistemde önemli rol oynayan peptidaz inhibitörlerini içerir11. Bu nedenle, yumuşakçalar gibi omurgasızlardan gelen peptidaz inhibitörleri potansiyel biyomedikal uygulamalara sahiptir, ancak birçoğu karakterize edilmeden kalır10,12,13. Bu bağlamda, Ontario’da yaklaşık 34 karasal yumuşakça türü ve Kanada’da 180 tatlı su yumuşakçasıtürü 14 bulunmaktadır. Bununla birlikte, derinlemesine profilleme ve karakterizasyonları halasınırlıdır 15. Bu organizmalar, potansiyel anti-fungal aktiviteye sahip yeni bileşiklerin tanımlanması için bir fırsat sunar10.
Bu protokolde, omurgasızlardan (örneğin, yumuşakçalar) ekstraktları izole etme ve netleştirme yöntemleri (Şekil 1) ve ardından varsayılan peptidaz inhibitör aktivitesini ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Bu ekstraktların antifungal özellikleri daha sonra fenotipik testler kullanılarak C. neoformans virülans faktörü üretimi üzerindeki etkileri ölçülerek değerlendirilir (Şekil 2). Ham ve berraklaştırılmış ekstraktlar arasındaki antifungal özelliklerdeki farklılıkların, deneysel gözlemleri etkileyebilecek yumuşakçaların mikrobiyal faktörlerinin (örneğin, konakçı mikrobiyomu tarafından üretilen ikincil metabolitler veya toksinler) göstergesi olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu tür bulgular, bu protokolün, eylem biçimlerini çözmek için hem ham hem de açıklığa kavuşturulmuş ekstraktları bağımsız olarak değerlendirme ihtiyacını desteklemektedir. Ek olarak, ekstraksiyon işlemi tarafsızdır ve çok sayıda mantar ve bakteriyel patojene karşı antimikrobiyal özelliklerin tespit edilmesini sağlayabilir. Bu nedenle, bu protokol, C. neoformans’a karşı antifungal özelliklere sahip yumuşakça türlerinin önceliklendirilmesi için bir başlangıç noktası ve enzimatik aktivite ile virülans faktörü üretimi arasındaki bağlantıların varsayılan inhibitör mekanizmalar aracılığıyla değerlendirilmesi için bir fırsat sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan ekstraksiyon protokolü, Ontario, Kanada’dan toplanan yumuşakçalardan bileşiklerin izolasyonunu özetlemekte ve yumuşakça ekstraktlarının insan mantar patojeni C. neoformans’a karşı kullanılmasının yeni bir araştırmasını göstermektedir. Bu protokol, omurgasızlardan peptidaz inhibitörü aktivitesini araştıran büyüyen bir araştırma grubuna katkıda bulunur13. Ekstraksiyon sırasında, bazı ekstrakt numunelerinin, muhtemelen filtre zarını tıkay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Geddes-McAlister Laboratuvarı üyelerine bu araştırma boyunca değerli destekleri ve el yazması geri bildirimleri için teşekkür eder. Yazarlar, Ontario Lisansüstü Bursu ve Uluslararası Lisansüstü Araştırma Ödülü – Guelph Üniversitesi’nden D. G.-G’ye ve Kanada İnovasyon Vakfı’ndan (JELF 38798) ve Ontario Kolejler ve Üniversiteler Bakanlığı’ndan – J. G.-M için Erken Araştırmacı Ödülü’nden gelen finansman desteğini kabul etmektedir.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
References
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
