评估软体动物粗提取物和澄清提取物的假定抗隐球菌特性
Summary
人类真菌病原体 Cryptococcus neoformans 产生多种毒力因子（例如肽酶），以促进其在宿主内的存活。环境生态位代表了新型天然肽酶抑制剂的有希望的来源。该协议概述了软体动物提取物的制备以及评估它们对真菌毒力因子产生的影响。
Abstract
新型隐球菌 是一种荚膜的人类真菌病原体，分布于全球，主要感染免疫功能低下的个体。抗真菌药物在临床环境中的广泛使用、其在农业中的使用以及品系杂交导致耐药性的进化增加。抗真菌药物耐药率的上升是全球临床医生和科学家日益关注的问题，开发新型抗真菌疗法的紧迫性也越来越高。例如， C. neoformans 产生几种毒力因子，包括细胞内和细胞外酶（例如肽酶），在组织降解，细胞调节和营养获取中起作用。抑制剂破坏这种肽酶活性会扰乱真菌的生长和增殖，这表明这可能是对抗病原体的重要策略。重要的是，软体动物等无脊椎动物产生具有生物医学应用和抗菌活性的肽酶抑制剂，但在对抗真菌病原体方面尚未得到充分探索。在该协议中，从软体动物中进行全局提取以分离粗提取物和澄清提取物中潜在的肽酶抑制剂，并评估它们对经典隐球菌毒力因子的影响。该方法支持对具有抗真菌特性的软体动物进行优先排序，并通过利用软体动物中发现的天然抑制剂为发现抗毒力剂提供了机会。
Introduction
新型隐球菌是一种人类真菌病原体，可在免疫功能低下的宿主（例如艾滋病毒/艾滋病感染者）中产生严重疾病1，并导致约19%的艾滋病相关死亡2。真菌对几类抗真菌药敏感，包括唑类、多烯类和氟胞嘧啶，它们使用不同的机制发挥杀真菌和抑真菌活性3，4。然而，在临床和农业环境中广泛使用抗真菌药物与菌株杂交相结合，放大了多种真菌物种（包括C. neoformans）耐药性的进化5。
为了克服抗真菌耐药性的挑战并在全球范围内降低真菌感染的流行率，一种有希望的方法是使用隐球菌属的毒力因子（例如，温度适应性、多糖胶囊、黑色素和细胞外酶）作为潜在的治疗靶点4，6.这种方法有几个优点，因为这些毒力因子在文献中得到了很好的表征，并且靶向这些因子可以通过损害毒力而不是靶向细胞生长来施加较弱的选择压力来潜在地降低抗真菌抗性率6。在这种情况下，许多研究已经评估了靶向细胞外酶（例如蛋白酶、肽酶）以降低或抑制隐球菌属 spp.7，8，9 的毒力的可能性。
无脊椎动物和植物等生物不具备适应性免疫系统来保护自己免受病原体的侵害。然而，它们依靠强大的先天免疫系统和大量的化合物来对付微生物和捕食者10。这些分子包括肽酶抑制剂，其在许多生物系统中起着重要作用，包括无脊椎动物免疫的细胞过程，例如血淋巴的凝固，细胞因子和抗菌肽的合成，以及通过直接灭活病原体的蛋白酶来保护宿主11。因此，来自软体动物等无脊椎动物的肽酶抑制剂具有潜在的生物医学应用，但许多仍未表征10，12，13。在这方面，安大略省大约有34种陆生软体动物，加拿大有180种淡水软体动物14种。然而，他们的深入剖析和表征仍然有限15.这些生物为鉴定具有潜在抗真菌活性的新化合物提供了机会10。
在该协议中，描述了分离和澄清无脊椎动物（例如软体动物）提取物的方法（图1），然后测量推定的肽酶抑制活性。然后通过使用表型测定法测量这些提取物对 C. neoformans 毒力因子产生的影响来评估这些提取物的抗真菌特性（图2）。重要的是要注意，粗提取物和澄清提取物之间的抗真菌特性差异可能表明软体动物的微生物因素（例如，宿主微生物组产生的次级代谢物或毒素），这可能会影响实验观察。这些发现支持该协议需要独立评估粗提取物和澄清提取物，以揭示作用模式。此外，提取过程是公正的，可以检测针对大量真菌和细菌病原体的抗菌特性。因此，该协议为优先考虑具有抗真菌特性的软体动物物种提供了一个起始点 ，并通过假定 的抑制机制评估酶活性与毒力因子产生之间的联系。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的提取方案概述了从加拿大安大略省收集的软体动物中分离化合物的方法，并展示了使用软体动物提取物对抗人类真菌病原体C . neoformans的新研究。该协议增加了越来越多的研究，调查无脊椎动物的肽酶抑制剂活性13。在提取过程中，一些提取物样品难以过滤灭菌，可能是由于存在可溶性多糖和/或阻碍滤膜的色素。为了克服这一限制，建议首先通过5μm膜过滤以排?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Geddes-McAlister实验室的成员在整个调查过程中的宝贵支持以及他们的手稿反馈。作者感谢安大略省研究生奖学金和国际研究生研究奖 – 圭尔夫大学到D.G.-G.以及加拿大创新基金会（JELF 38798）和安大略省学院和大学部 – J.G.-M.的早期研究员奖的资助。
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
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