मोलस्क से कच्चे और स्पष्ट अर्क के कथित एंटीक्रिप्टोकोकल गुणों का आकलन करना
Summary
मानव कवक रोगज़नक़ क्रिप्टोकोकस नियोफोरमैन मेजबान के भीतर अपने अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए विभिन्न प्रकार के विषाणु कारकों (जैसे, पेप्टिडेस) का उत्पादन करता है। पर्यावरणीय niches नए प्राकृतिक पेप्टिडेस अवरोधकों के एक आशाजनक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह प्रोटोकॉल मोलस्क से अर्क की तैयारी और फंगल विषाणु कारक उत्पादन पर उनके प्रभाव के आकलन को रेखांकित करता है।
Abstract
क्रिप्टोकोकस नियोफोरमैन एक वैश्विक वितरण के साथ एक एनकैप्सुलेटेड मानव फंगल रोगज़नक़ है जो मुख्य रूप से इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों को संक्रमित करता है। नैदानिक सेटिंग्स में एंटिफंगल के व्यापक उपयोग, कृषि में उनके उपयोग और तनाव संकरण ने प्रतिरोध के विकास में वृद्धि की है। एंटिफंगल के खिलाफ प्रतिरोध की यह बढ़ती दर दुनिया भर के चिकित्सकों और वैज्ञानिकों के बीच एक बढ़ती चिंता है, और नए एंटिफंगल उपचार विकसित करने की तात्कालिकता बढ़ गई है। उदाहरण के लिए, सी नियोफोरमैन कई विषाणु कारकों का उत्पादन करता है, जिसमें ऊतक क्षरण, सेलुलर विनियमन और पोषक तत्व अधिग्रहण में भूमिका के साथ इंट्रा-और एक्स्ट्रा-सेलुलर एंजाइम (जैसे, पेप्टिडेस) शामिल हैं। अवरोधकों द्वारा इस तरह की पेप्टिडेस गतिविधि का विघटन फंगल विकास और प्रसार को परेशान करता है, यह सुझाव देता है कि यह रोगज़नक़ का मुकाबला करने के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति हो सकती है। महत्वपूर्ण रूप से, मोलस्क जैसे अकशेरुकी बायोमेडिकल अनुप्रयोगों और एंटी-माइक्रोबियल गतिविधि के साथ पेप्टिडेस इनहिबिटर का उत्पादन करते हैं, लेकिन फंगल रोगजनकों के खिलाफ उनके उपयोग के संदर्भ में उन्हें कम किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, कच्चे और स्पष्ट अर्क में संभावित पेप्टिडेस इनहिबिटर को अलग करने के लिए मोलस्क से एक वैश्विक निष्कर्षण किया गया था, और शास्त्रीय क्रिप्टोकोकल विषाणु कारकों के खिलाफ उनके प्रभावों का आकलन किया गया था। यह विधि एंटिफंगल गुणों के साथ मोलस्क की प्राथमिकता का समर्थन करती है और मोलस्क में पाए जाने वाले प्राकृतिक अवरोधकों का उपयोग करके एंटी-विषाणु एजेंटों की खोज के अवसर प्रदान करती है।
Introduction
क्रिप्टोकोकस नियोफोरमैन एक मानव फंगल रोगज़नक़ है जो इम्युनोकॉम्प्रोमाइज्ड मेजबानों में गंभीर बीमारी पैदा करता है, जैसे कि एचआईवी / एड्स1 के साथ रहने वाले व्यक्ति, और एड्स से संबंधित मौतों का लगभग 19% होताहै। कवक एंटिफंगल के कई वर्गों के लिए अतिसंवेदनशील है, जिसमें एज़ोल्स, पॉलीएन और फ्लुसाइटोसिन शामिल हैं, जो अलग-अलग तंत्र 3,4 का उपयोग करके कवकनाशी और कवकनाशी गतिविधि को बढ़ाते हैं। हालांकि, तनाव संकरण के साथ संयुक्त नैदानिक और कृषि सेटिंग्स में एंटिफंगल के व्यापक उपयोग ने सी नियोफोरमैन्स5 सहित कई फंगल प्रजातियों में प्रतिरोध के विकास को बढ़ाया है।
एंटिफंगल प्रतिरोध की चुनौतियों को दूर करने और वैश्विक स्तर पर फंगल संक्रमण के प्रसार को कम करने के लिए, एक आशाजनक दृष्टिकोण क्रिप्टोकोकस एसपीपी (जैसे, तापमान अनुकूलनशीलता, पॉलीसेकेराइड कैप्सूल, मेलेनिन और बाह्य एंजाइम) के विषाणु कारकों का उपयोग करना है। . इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं, क्योंकि इन विषाणु कारकों को साहित्य में अच्छी तरह से चित्रित किया गया है, और इन कारकों को लक्षित करने से सेल विकास को लक्षित करने के बजाय उग्रता को कम करने के माध्यम से कमजोर चयनात्मक दबाव लागू करके एंटिफंगल प्रतिरोध की दरों को कमकिया जा सकता है। इस संदर्भ में, कई अध्ययनों ने क्रिप्टोकोकस एसपीपी 7,8,9 की उग्रता को कम करने या रोकने के लिए बाह्य एंजाइमों (जैसे, प्रोटीज, पेप्टिडेस) को लक्षित करने की संभावना का आकलन किया है।
अकशेरुकी और पौधों जैसे जीवों में रोगजनकों से खुद को बचाने के लिए अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली नहीं होती है। हालांकि, वे सूक्ष्मजीवों और शिकारियों से निपटने के लिए रासायनिक यौगिकों की एक विशाल सरणी के साथ एक मजबूत जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली परभरोसा करते हैं। इन अणुओं में पेप्टिडेस इनहिबिटर शामिल हैं, जो कई जैविक प्रणालियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जिसमें अकशेरुकी प्रतिरक्षा की सेलुलर प्रक्रियाएं शामिल हैं, जैसे कि हेमोलिम्फ की जमावट, साइटोकिन्स और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स का संश्लेषण, और रोगजनकों के प्रोटीज को सीधे निष्क्रिय करके मेजबानों की सुरक्षा। इस प्रकार, मोलस्क जैसे अकशेरुकी जीवों से पेप्टिडेस इनहिबिटर में संभावित बायोमेडिकल अनुप्रयोग होते हैं, लेकिन कई 10,12,13 की विशेषता नहीं रखते हैं। इस संदर्भ में, ओंटारियो में स्थलीय मोलस्क की लगभग 34 प्रजातियां और कनाडा में 180 मीठे पानी के मोलस्कहैं। हालांकि, उनकी गहन प्रोफाइलिंग और लक्षण वर्णन अभीभी सीमित हैं। ये जीव संभावित एंटी-फंगल गतिविधि10 के साथ नए यौगिकों की पहचान के लिए एक अवसर प्रस्तुत करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, अकशेरुकी जीवों (जैसे, मोलस्क) (चित्रा 1) से अर्क को अलग करने और स्पष्ट करने के तरीकों का वर्णन किया गया है, जिसके बाद कथित पेप्टिडेस निरोधात्मक गतिविधि को मापा जाता है। इन अर्क के एंटिफंगल गुणों का मूल्यांकन तब फेनोटाइपिक परख (चित्रा 2) का उपयोग करके सी नियोफोरमैन्स विषाणु कारक उत्पादन पर उनके प्रभाव को मापकर किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कच्चे और स्पष्ट अर्क के बीच एंटिफंगल गुणों में अंतर मोलस्क के माइक्रोबियल कारकों (जैसे, द्वितीयक मेटाबोलाइट्स या मेजबान माइक्रोबायोम द्वारा उत्पादित विषाक्त पदार्थों) का संकेत हो सकता है, जो प्रयोगात्मक टिप्पणियों को प्रभावित कर सकता है। इस तरह के निष्कर्ष कार्रवाई के तरीकों को उजागर करने के लिए स्वतंत्र रूप से कच्चे और स्पष्ट अर्क दोनों का आकलन करने के लिए इस प्रोटोकॉल की आवश्यकता का समर्थन करते हैं। इसके अतिरिक्त, निष्कर्षण प्रक्रिया निष्पक्ष है और फंगल और बैक्टीरियल रोगजनकों के ढेरों के खिलाफ रोगाणुरोधी गुणों का पता लगाने में सक्षम हो सकती है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल सी नियोफोरमैन के खिलाफ एंटिफंगल गुणों के साथ मोलस्क प्रजातियों की प्राथमिकता के लिए एक दीक्षा बिंदु प्रदान करता है और कथित निरोधात्मक तंत्र के माध्यम से एंजाइमेटिक गतिविधि और विषाणु कारक उत्पादन के बीच संबंधों का मूल्यांकन करने का अवसर प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित निष्कर्षण प्रोटोकॉल ओन्टारियो, कनाडा से एकत्र किए गए मोलस्क से यौगिकों के अलगाव को रेखांकित करता है, और मानव कवक रोगज़नक़, सी नियोफोरमैन के खिलाफ मोलस्क अर्क का उपयोग करने की एक नई जांच ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस जांच और उनकी पांडुलिपि प्रतिक्रिया के दौरान उनके मूल्यवान समर्थन के लिए गेडेस-मैकएलिस्टर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। लेखक ओंटारियो ग्रेजुएट स्कॉलरशिप और इंटरनेशनल ग्रेजुएट रिसर्च अवार्ड – गुएल्फ विश्वविद्यालय से डीजी-जी और कैनेडियन फाउंडेशन ऑफ इनोवेशन (जेईएलएफ 38798) और ओंटारियो मिनिस्ट्री ऑफ कॉलेज एंड यूनिवर्सिटीज – जेजी-एम के लिए प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार से वित्त पोषण समर्थन को स्वीकार करते हैं।
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
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