연체 동물의 원유 및 정제 추출물의 추정 항 크립토 코커스 특성 평가
Summary
인간 진균 병원체인 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 숙주 내에서 생존을 촉진하기 위해 다양한 독성 인자(예: 펩티다아제)를 생성합니다. 환경적 틈새는 새로운 천연 펩티다아제 억제제의 유망한 공급원입니다. 이 프로토콜은 연체 동물 추출물의 준비와 곰팡이 독성 인자 생산에 미치는 영향에 대한 평가를 간략하게 설명합니다.
Abstract
크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans )는 캡슐화된 인간 진균 병원체로 전 세계적으로 분포하여 주로 면역 저하 개체를 감염시킵니다. 임상 환경에서 항진균제의 광범위한 사용, 농업에서의 사용 및 균주 교잡은 내성의 진화를 증가시켰습니다. 항진균제에 대한 내성 증가율은 전 세계 임상의와 과학자들 사이에서 우려가 커지고 있으며 새로운 항진균 요법 개발의 시급성이 높아지고 있습니다. 예를 들어, C. neoformans 는 조직 분해, 세포 조절 및 영양소 획득에 역할을 하는 세포내 및 세포외 효소(예: 펩티다아제)를 포함한 여러 독성 인자를 생성합니다. 억제제에 의한 이러한 펩티다아제 활성의 중단은 곰팡이의 성장과 증식을 교란시켜 이것이 병원체 퇴치를 위한 중요한 전략이 될 수 있음을 시사합니다. 중요한 것은 연체 동물과 같은 무척추 동물이 생물 의학 응용 및 항균 활성을 가진 펩티다제 억제제를 생산하지만 곰팡이 병원체에 대한 사용 측면에서 충분히 연구되지 않았다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 연체동물에서 글로벌 추출을 수행하여 조잡하고 정제된 추출물에서 잠재적인 펩티다제 억제제를 분리하고 고전적인 크립토코커스 독성 인자에 대한 효과를 평가했습니다. 이 방법은 항진균 특성을 가진 연체동물의 우선 순위를 지원하고 연체동물에서 발견되는 천연 억제제를 활용하여 항독성제를 발견할 수 있는 기회를 제공합니다.
Introduction
크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)는 HIV/AIDS 보균자와 같은 면역 저하 숙주에서 심각한 질병을 일으키는 인간 진균 병원체이며1, AIDS 관련 사망의 약 19%를 차지한다2. 곰팡이는 아졸, 폴리엔 및 플루시토신을 포함한 여러 종류의 항진균제에 취약하며, 이는 뚜렷한 메커니즘을 사용하여 살균 및 살균 활성을 발휘합니다 3,4. 그러나 임상 및 농업 환경에서 항진균제의 광범위한 사용과 균주 교잡은 C. neoformans5를 포함한 여러 곰팡이 종에서 내성의 진화를 증폭시켰다.
항진균 내성 문제를 극복하고 전 세계적으로 진균 감염의 유병률을 줄이기 위해, 유망한 접근법은 크립토코커스 종의 독성 인자(예: 온도 적응성, 다당류 캡슐, 멜라닌 및 세포외 효소)를 잠재적인 치료 표적으로 사용하는 것이다 4,6 . 이러한 독성 인자는 문헌에 잘 특성화되어 있고, 이러한 인자를 표적으로 삼으면 세포 성장을 표적으로 삼는 것이 아니라 독성을 손상시켜 더 약한 선택 압력을 가함으로써 항진균 내성 비율을 잠재적으로 감소시킬 수 있기 때문에 이러한 접근법은 몇 가지 장점이 있다6. 이러한 맥락에서 많은 연구에서 크립토코커스 종 7,8,9의 독성을 감소시키거나 억제하기 위해 세포외 효소(예: 프로테아제, 펩티다아제)를 표적으로 삼을 가능성을 평가했습니다.
무척추 동물 및 식물과 같은 유기체는 병원체로부터 자신을 보호하기 위한 적응 면역 체계를 가지고 있지 않습니다. 그러나 그들은 미생물과 포식자를 다루기 위해 엄청난 양의 화합물을 가진 강력한 선천성 면역 체계에 의존합니다10. 이러한 분자에는 펩티다아제 억제제가 포함되어 있는데, 이는 체림프 응고, 사이토카인 및 항균 펩타이드의 합성, 병원체의 프로테아제를 직접 불활성화하여 숙주를 보호하는 것과 같은 무척추동물 면역의 세포 과정을 포함하여 많은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다11. 따라서, 연체동물과 같은 무척추동물의 펩티다아제 억제제는 잠재적인 생물의학적 응용을 가지고 있지만, 많은 것들이 특성화되지 않은 채로 남아 있다10,12,13. 이러한 맥락에서 온타리오에는 약 34종의 육상 연체동물이 있고 캐나다에는 180종의 민물 연체동물이 있습니다14. 그러나 심층적 인 프로파일 링 및 특성화는 여전히 제한적입니다15. 이 유기체들은 잠재적인 항진균 활성을 가진 새로운 화합물의 식별을 위한 기회를 제공한다10.
이 프로토콜에서는 무척추동물(예: 연체동물)에서 추출물을 분리하고 명확히 하는 방법(그림 1)을 설명한 후 추정되는 펩티다아제 억제 활성을 측정하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 표현형 분석을 사용하여 C. neoformans 독성 인자 생산에 미치는 영향을 측정하여 이러한 추출물의 항진균 특성을 평가합니다(그림 2). 원유 추출물과 정제 추출물 사이의 항진균 특성의 차이는 연체 동물의 미생물 인자(예: 숙주 미생물군집에 의해 생성된 2차 대사 산물 또는 독소)를 나타낼 수 있으며, 이는 실험적 관찰에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 발견은 작용 방식을 밝히기 위해 조잡한 추출물과 정제된 추출물을 독립적으로 평가하기 위한 이 프로토콜의 필요성을 뒷받침합니다. 또한 추출 공정은 편향되지 않으며 과다한 곰팡이 및 박테리아 병원체에 대한 항균 특성을 검출할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 C. neoformans 에 대한 항진균 특성을 가진 연체동물 종의 우선 순위를 정하기 위한 시작점과 추정 억제 메커니즘을 통해 효소 활성과 독성 인자 생산 사이의 연관성을 평가할 수 있는 기회를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 추출 프로토콜은 캐나다 온타리오에서 수집한 연체동물에서 화합물을 분리하는 방법을 설명하고 인간 진균 병원체인 C. neoformans에 대한 연체동물 추출물 사용에 대한 새로운 조사를 보여줍니다. 이 프로토콜은 무척추동물의 펩티다아제 억제제 활성을 조사하는 연구의 증가에 추가된다13. 추출하는 동안 일부 추출물 샘플은 필터 멤브레인을 막는 가용성 다?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 조사와 원고 피드백 전반에 걸쳐 귀중한 지원을 해준 Geddes-McAlister Lab 회원들에게 감사를 표합니다. 저자는 온타리오 대학원 장학금 및 국제 대학원 연구상 – University of Guelph에서 D.G.-G까지, 캐나다 혁신 재단(JELF 38798) 및 온타리오 대학 및 대학부 – J.G.-M에 대한 조기 연구원 상.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
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