Evaluación de las propiedades anticriptocócicas putativas de extractos crudos y clarificados de moluscos
Summary
El patógeno fúngico humano Cryptococcus neoformans produce una variedad de factores de virulencia (por ejemplo, peptidasas) para promover su supervivencia dentro del huésped. Los nichos ambientales representan una fuente prometedora de nuevos inhibidores naturales de la peptidasa. Este protocolo describe la preparación de extractos de moluscos y la evaluación de su efecto sobre la producción de factores de virulencia fúngica.
Abstract
Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano encapsulado con una distribución global que infecta principalmente a individuos inmunocomprometidos. El uso generalizado de antifúngicos en entornos clínicos, su uso en la agricultura y la hibridación de cepas han llevado a una mayor evolución de la resistencia. Esta creciente tasa de resistencia contra los antifúngicos es una preocupación creciente entre los médicos y científicos de todo el mundo, y existe una mayor urgencia para desarrollar nuevas terapias antimicóticas. Por ejemplo, C. neoformans produce varios factores de virulencia, incluyendo enzimas intra y extracelulares (por ejemplo, peptidasas) con roles en la degradación de tejidos, regulación celular y adquisición de nutrientes. La interrupción de dicha actividad peptidasa por inhibidores perturba el crecimiento y la proliferación de hongos, lo que sugiere que esta puede ser una estrategia importante para combatir el patógeno. Es importante destacar que los invertebrados como los moluscos producen inhibidores de la peptidasa con aplicaciones biomédicas y actividad antimicrobiana, pero están poco explorados en términos de su uso contra patógenos fúngicos. En este protocolo, se realizó una extracción global de moluscos para aislar posibles inhibidores de peptidasa en extractos crudos y clarificados, y se evaluaron sus efectos contra los factores clásicos de virulencia criptocócica. Este método apoya la priorización de moluscos con propiedades antifúngicas y brinda oportunidades para el descubrimiento de agentes antivirulentes al aprovechar los inhibidores naturales que se encuentran en los moluscos.
Introduction
Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano que produce enfermedad grave en huéspedes inmunocomprometidos, como las personas que viven con VIH / SIDA1, y conduce a aproximadamente el 19% de las muertes relacionadas con el SIDA2. El hongo es susceptible a varias clases de antifúngicos, incluyendo azoles, polienos y flucitosina, que ejercen actividad fungicida y fungistática utilizando mecanismos distintos 3,4. Sin embargo, el uso extensivo de antifúngicos en entornos clínicos y agrícolas combinado con la hibridación de cepas ha amplificado la evolución de la resistencia en múltiples especies de hongos, incluyendo C. neoformans5.
Para superar los desafíos de la resistencia a los antifúngicos y reducir la prevalencia de infecciones fúngicas a escala global, un enfoque prometedor es utilizar los factores de virulencia de Cryptococcus spp. (por ejemplo, adaptabilidad a la temperatura, cápsula de polisacáridos, melanina y enzimas extracelulares) como posibles objetivos terapéuticos 4,6 . Este enfoque tiene varias ventajas, ya que estos factores de virulencia están bien caracterizados en la literatura, y dirigirse a estos factores podría reducir potencialmente las tasas de resistencia a los antifúngicos al imponer una presión selectiva más débil al perjudicar la virulencia en lugar de apuntar al crecimiento celular6. En este contexto, numerosos estudios han evaluado la posibilidad de dirigirse a enzimas extracelulares (por ejemplo, proteasas, peptidasas) para reducir o inhibir la virulencia de Cryptococcus spp.7,8,9.
Los organismos como los invertebrados y las plantas no poseen un sistema inmune adaptativo para protegerse de los patógenos. Sin embargo, dependen de un fuerte sistema inmune innato con una inmensa variedad de compuestos químicos para hacer frente a microorganismos y depredadores10. Estas moléculas incluyen inhibidores de peptidasa, que juegan un papel importante en muchos sistemas biológicos, incluyendo los procesos celulares de inmunidad de invertebrados, como la coagulación de la hemolinfa, la síntesis de citoquinas y péptidos antimicrobianos, y la protección de los huéspedes mediante la inactivación directa de las proteasas de los patógenos11. Por lo tanto, los inhibidores de peptidasa de invertebrados como los moluscos poseen aplicaciones biomédicas potenciales, pero muchos permanecen sin caracterizar10,12,13. En este contexto, hay aproximadamente 34 especies de moluscos terrestres en Ontario y 180 moluscos de agua dulce en Canadá14. Sin embargo, su perfil y caracterización en profundidad aún son limitados15. Estos organismos presentan una oportunidad para la identificación de nuevos compuestos con potencial actividad antifúngica10.
En este protocolo, se describen métodos para aislar y aclarar extractos de invertebrados (por ejemplo, moluscos) (Figura 1) seguidos de medir la supuesta actividad inhibidora de la peptidasa. Las propiedades antifúngicas de estos extractos se evalúan midiendo su impacto en la producción del factor de virulencia de C. neoformans utilizando ensayos fenotípicos (Figura 2). Es importante tener en cuenta que las diferencias en las propiedades antifúngicas entre los extractos crudos y clarificados pueden ser indicativas de factores microbianos (por ejemplo, metabolitos secundarios o toxinas producidas por el microbioma huésped) del molusco, que pueden influir en las observaciones experimentales. Tales hallazgos respaldan la necesidad de que este protocolo evalúe extractos crudos y aclarados de forma independiente para desentrañar los modos de acción. Además, el proceso de extracción es imparcial y puede permitir la detección de propiedades antimicrobianas contra una gran cantidad de patógenos fúngicos y bacterianos. Por lo tanto, este protocolo proporciona un punto de partida para la priorización de especies de moluscos con propiedades antifúngicas contra C. neoformans y una oportunidad para evaluar las conexiones entre la actividad enzimática y la producción de factores de virulencia a través de supuestos mecanismos inhibitorios.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de extracción descrito aquí describe el aislamiento de compuestos de moluscos recolectados en Ontario, Canadá, y demuestra una investigación novedosa del uso de extractos de moluscos contra el patógeno fúngico humano, C. neoformans. Este protocolo se suma a un creciente cuerpo de investigación que investiga la actividad de los inhibidores de peptidasa de los invertebrados13. Durante la extracción, algunas muestras de extracto fueron difíciles de filtrar-esterilizar, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los miembros del Laboratorio Geddes-McAlister por su valioso apoyo a lo largo de esta investigación y sus comentarios sobre el manuscrito. Los autores reconocen el apoyo financiero de la Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award – University of Guelph a D. G.-G y de la Fundación Canadiense de Innovación (JELF 38798) y Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award para J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
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