Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci
Summary
Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.
Abstract
Nonostante i notevoli progressi nella comprensione della biologia tumorale, la stragrande maggioranza dei candidati farmaci oncologici che entrano negli studi clinici falliscono, spesso a causa della mancanza di efficacia clinica. Questo alto tasso di fallimento illumina l’incapacità degli attuali modelli preclinici di prevedere l’efficacia clinica, principalmente a causa della loro inadeguatezza nel riflettere l’eterogeneità del tumore e il microambiente tumorale. Queste limitazioni possono essere affrontate con modelli di coltura tridimensionali (3D) (sferoidi) stabiliti da campioni di tumore umano derivati da singoli pazienti. Queste colture 3D rappresentano la biologia del mondo reale meglio delle linee cellulari stabilite che non riflettono l’eterogeneità del tumore. Inoltre, le colture 3D sono migliori dei modelli di coltura bidimensionale (2D) (strutture monostrato) poiché replicano elementi dell’ambiente tumorale, come ipossia, necrosi e adesione cellulare, e preservano la forma e la crescita naturale delle cellule. Nel presente studio, è stato sviluppato un metodo per preparare colture primarie di cellule tumorali da singoli pazienti che sono 3D e crescono in sferoidi multicellulari. Le cellule possono essere derivate direttamente da tumori del paziente o xenotrapianti derivati dal paziente. Il metodo è ampiamente applicabile ai tumori solidi (ad esempio, colon, seno e polmone) ed è anche conveniente, in quanto può essere eseguito nella sua interezza in un tipico laboratorio di ricerca sul cancro / biologia cellulare senza fare affidamento su attrezzature specializzate. Qui viene presentato un protocollo per generare modelli di coltura tumorale 3D (sferoidi multicellulari) da cellule tumorali primarie e valutare la loro sensibilità ai farmaci utilizzando due approcci complementari: un saggio di vitalità cellulare (MTT) e esami microscopici. Questi sferoidi multicellulari possono essere utilizzati per valutare potenziali candidati farmacologici, identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e studiare i meccanismi di risposta e resistenza.
Introduction
Gli studi in vitro e in vivo rappresentano approcci complementari per lo sviluppo di trattamenti contro il cancro. I modelli in vitro consentono il controllo della maggior parte delle variabili sperimentali e facilitano le analisi quantitative. Spesso fungono da piattaforme di screening a basso costo e possono essere utilizzati anche per studi meccanicistici1. Tuttavia, la loro rilevanza biologica è intrinsecamente limitata, in quanto tali modelli riflettono solo parzialmente il microambiente tumorale1. Al contrario, i modelli in vivo, come gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX), catturano la complessità del microambiente tumorale e sono più adatti per studi traslazionali e trattamenti individualizzanti nei pazienti (cioè, studiando la risposta ai farmaci in un modello derivato da un singolo paziente)1. Tuttavia, i modelli in vivo non favoriscono approcci ad alto rendimento per lo screening dei farmaci, poiché i parametri sperimentali non possono essere controllati strettamente come nei modelli in vitro e perché il loro sviluppo richiede tempo, manodopera e costoso 1,2.
I modelli in vitro sono disponibili da oltre 100 anni e le linee cellulari sono disponibili da oltre 70 anni3. Negli ultimi decenni, tuttavia, la complessità dei modelli in vitro disponibili di tumori solidi è aumentata drammaticamente. Questa complessità varia da modelli di coltura 2-dimensionali (2D) (strutture monostrato) che sono linee cellulari stabilite derivate dal tumore o linee cellulari primarie agli approcci più recenti che coinvolgono modelli tridimensionali (3D)1. All’interno dei modelli 2D, una distinzione chiave è tra le linee cellulari stabilite e primarie4. Le linee cellulari stabilite sono immortalate; Pertanto, la stessa linea cellulare può essere utilizzata globalmente per molti anni, il che da una prospettiva storica, facilita la collaborazione, l’accumulo di dati e lo sviluppo di molte strategie di trattamento. Tuttavia, le aberrazioni genetiche in queste linee cellulari si accumulano ad ogni passaggio, compromettendo così la loro rilevanza biologica. Inoltre, il numero limitato di linee cellulari disponibili non riflette l’eterogeneità dei tumori nei pazienti 4,5. Le linee cellulari tumorali primarie derivano direttamente da campioni tumorali resecati ottenuti tramite biopsie, versamenti pleurici o resezioni. Pertanto, le linee cellulari tumorali primarie sono biologicamente più rilevanti in quanto conservano elementi del microambiente tumorale e le caratteristiche tumorali, come i comportamenti intercellulari (ad esempio, cross-talk tra cellule sane e cancerose) e i fenotipi staminali delle cellule tumorali. Tuttavia, la capacità replicativa delle linee cellulari primarie è limitata, il che porta a un tempo di coltura ristretto e limita il numero di cellule tumorali che possono essere utilizzate per le analisi 4,5.
I modelli che utilizzano colture 3D sono biologicamente più rilevanti dei modelli di coltura 2D poiché le condizioni in vivo vengono mantenute. Pertanto, i modelli di coltura 3D preservano la forma e la crescita naturale delle cellule e replicano elementi dell’ambiente tumorale, come ipossia, necrosi e adesione cellulare. I modelli 3D più comunemente usati nella ricerca sul cancro includono sferoidi multicellulari, strutture basate su scaffold e colture incorporate nella matrice 4,6,7.
Il presente protocollo genera modelli di coltura tumorale 3D (sferoidi multicellulari) da cellule tumorali primarie e valuta la loro sensibilità ai farmaci utilizzando due approcci complementari: un saggio di vitalità cellulare (MTT) ed esami microscopici. I risultati rappresentativi qui presentati provengono dal cancro al seno e al colon; Tuttavia, questo protocollo è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido (ad esempio, colangiocarcinoma, cancro gastrico, polmonare e pancreatico) ed è anche conveniente, in quanto può essere eseguito nella sua interezza in un tipico laboratorio di ricerca sul cancro / biologia cellulare senza fare affidamento su attrezzature specializzate. Gli sferoidi multicellulari generati utilizzando questo approccio possono essere utilizzati per valutare potenziali candidati farmacologici, identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e studiare i meccanismi di risposta e resistenza.
Questo protocollo è diviso in tre sezioni: (1) la generazione, la raccolta e il conteggio degli sferoidi in preparazione al loro uso come modello per testare l’efficacia dei farmaci; (2) Saggio MTT per valutare l’efficacia del farmaco sugli sferoidi; e (3) la valutazione microscopica dei cambiamenti morfologici a seguito del trattamento degli sferoidi con farmaci come un altro approccio per valutare l’efficacia del farmaco (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo descrive un metodo semplice per generare colture cellulari primarie 3D (sferoidi) derivate da campioni tumorali umani. Questi sferoidi possono essere utilizzati per varie analisi, tra cui la valutazione di potenziali candidati farmaci e combinazioni di farmaci, l’identificazione di potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e lo studio dei meccanismi di risposta e resistenza. Il protocollo utilizza cellule tumorali primarie derivate direttamente da campioni di pazienti o cellule tumorali da mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lot 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Cell Dissociation |
| Cisplatin | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatin, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Basement membrane matrix, type 3 |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer ELISA reader | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | for stop solution |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Version 1.52a | Open-source software ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | for stop solution |
| L-glutamine | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium |
| Penicillin–streptomycin | Invitrogen | 2119399 | |
| Phenol-free RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Pippeting reservoir | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann – La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological industries, Israel | 03-102-1B | |
| Ultra-low attachment 96 well plate | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
References
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