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Neuroscience

Pupillométrie pour évaluer la sensation auditive chez les cobayes

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64581
Automatic Translation
1,2, 1,2,4, 1,2,6, 1,2,3,4,5
1Department of Neurobiology, University of Pittsburgh, 2Center for Neuroscience, University of Pittsburgh, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 4Center for Neural Basis of Cognition, University of Pittsburgh, 5Department of Communication Science and Disorders, University of Pittsburgh, 6Department of Transfer and Innovation, USC University Hospital Complex (CHUS), University of Santiago de Compostela

Summary

La pupillométrie, technique simple et non invasive, est proposée comme méthode pour déterminer les seuils d’audition dans le bruit chez les animaux entendants normaux et les modèles animaux de diverses pathologies auditives.

Abstract

L’exposition au bruit est l’une des principales causes de perte auditive neurosensorielle. Les modèles animaux de perte auditive induite par le bruit ont généré un aperçu mécaniste des pathologies anatomiques et physiologiques sous-jacentes de la perte auditive. Cependant, relier les déficits comportementaux observés chez les humains atteints de perte auditive aux déficits comportementaux dans les modèles animaux reste difficile. Ici, la pupillométrie est proposée comme une méthode qui permettra la comparaison directe des données comportementales animales et humaines. La méthode est basée sur un paradigme bizarre modifié - habituant le sujet à la présentation répétée d’un stimulus et présentant par intermittence un stimulus déviant qui varie de manière paramétrique du stimulus répété. La prémisse fondamentale est que si le changement entre le stimulus répété et le stimulus déviant est détecté par le sujet, il déclenchera une réponse de dilatation pupillaire plus importante que celle provoquée par le stimulus répété. Cette approche est démontrée à l’aide d’une tâche de catégorisation de vocalisation chez les cobayes, un modèle animal largement utilisé dans la recherche auditive, y compris dans les études de perte auditive. En présentant les vocalisations d’une catégorie de vocalisation comme des stimuli standard et d’une deuxième catégorie comme des stimuli bizarres intégrés dans le bruit à divers rapports signal sur bruit, il est démontré que l’ampleur de la dilatation de la pupille en réponse à la catégorie oddball varie de manière monotone avec le rapport signal sur bruit. Les analyses de la courbe de croissance peuvent ensuite être utilisées pour caractériser l’évolution temporelle et la signification statistique de ces réponses de dilatation des pupilles. Dans ce protocole, des procédures détaillées pour acclimater les cobayes à la configuration, effectuer une pupillométrie et évaluer / analyser les données sont décrites. Bien que cette technique soit démontrée chez des cobayes entendants normaux dans ce protocole, la méthode peut être utilisée pour évaluer les effets sensoriels de diverses formes de perte auditive chez chaque sujet. Ces effets peuvent ensuite être corrélés avec des mesures électrophysiologiques simultanées et des observations anatomiques post-hoc.

Introduction

Le diamètre de la pupille () peut être affecté par un grand nombre de facteurs et la mesure de la MP qui change au fil du temps est connue sous le nom de pupillométrie. La MP est contrôlée par le muscle du sphincter de l’iris (impliqué dans la constriction) et le muscle dilatateur de l’iris (impliqué dans la dilatation). Le muscle de constriction est innervé par le système parasympathique et implique des projections cholinergiques, tandis que le dilatateur de l’iris est innervé par le système sympathique impliquant des projections noradrénergiques et cholinergiques 1,2,3. Le stimulus le plus connu pour induire des changements de est la luminance-constriction et les réponses de dilatation de la pupille peuvent être produites par des variations de l’intensité de la lumière ambiante2. La DP change également en fonction de la distance focale2. On sait depuis des décennies, cependant, que montre également des fluctuations non liées à la luminance 4,5,6,7. Par exemple, les changements dans les états mentaux internes peuvent provoquer des changements transitoires de la MP. La pupille se dilate en réponse à des stimuli chargés d’émotion ou augmente avec l’excitation 4,5,8,9. La dilatation des pupilles pourrait également être liée à d’autres mécanismes cognitifs, tels qu’une augmentation de l’effort mental ou de l’attention10,11,12,13. En raison de cette relation entre les variations de la taille des pupilles et les états mentaux, les changements de la MP ont été explorés comme marqueur de troubles cliniques tels que la schizophrénie 14,15, l’anxiété 16,17,18, la maladie de Parkinson 19,20 et la maladie d’Alzheimer 21 , entre autres. Chez les animaux, les changements de MP suivent les états comportementaux internes et sont corrélés avec les niveaux d’activité neuronale dans les zones corticales22,23,24,25. Le diamètre de la pupille s’est également avéré être un indicateur fiable de l’état du sommeil chez la souris26. Ces changements de liés à l’excitation et à l’état interne se produisent généralement sur de longues échelles de temps de l’ordre de plusieurs dizaines de secondes.

Dans le domaine de la recherche auditive, chez les sujets malentendants normaux ainsi que chez les sujets malentendants, l’effort d’écoute et la perception auditive ont été évalués par pupillométrie. Ces études impliquent généralement des sujets de recherche formés27,28,29,30 qui effectuent divers types de tâches de détection ou de reconnaissance. En raison de la relation susmentionnée entre l’excitation et la MP, il a été démontré qu’un engagement accru dans les tâches et un effort d’écoute étaient corrélés à une augmentation des réponses de dilatation des pupilles 30,31,32,33,34,35. Ainsi, la pupillométrie a été utilisée pour démontrer qu’un effort d’écoute accru est déployé pour reconnaître la parole dégradée spectralement chez les auditeurs entendants normaux29,36. Chez les auditeurs malentendants, tels que les humains ayant une perte auditive liée à l’âge 27,30,37,38,39,40,41 et les utilisateurs d’implants cochléaires 42,43, les réponses des pupilles ont également augmenté avec la diminution de l’intelligibilité de la parole; Cependant, les auditeurs malentendants ont montré une plus grande dilatation des pupilles dans des conditions d’écoute plus faciles par rapport aux sujets auditifs normaux 27,30,37,38,39,40,41,42,43. Mais les expériences qui nécessitent que l’auditeur effectue une tâche de reconnaissance ne sont pas toujours possibles - par exemple, chez les nourrissons ou dans certains modèles animaux. Ainsi, les réponses pupillaires non liées à la luminance évoquées par des stimuli acoustiques pourraient être une méthode alternative viable pour évaluer la détection auditive dans ces cas44,45. Des études antérieures ont démontré une dilatation transitoire et liée au stimulus de la pupille dans le cadre du réflexe d’orientation46. Des études ultérieures ont démontré l’utilisation de dilatations pupillaires liées à un stimulus pour calculer des courbes de sensibilité à la fréquence chez les hiboux47,48. Récemment, ces méthodes ont été adaptées pour évaluer la sensibilité de la réponse à la dilatation pupillaire chez les nourrissons humains48. La pupillométrie s’est révélée être une approche fiable et non invasive pour estimer les seuils de détection auditive et de discrimination chez les cobayes à écoute passive en utilisant un large éventail de stimuli simples (tons) et complexes (vocalisations GP)49. Ces changements de DP liés au stimulus se produisent généralement à des échelles de temps plus rapides de l’ordre de plusieurs secondes et sont liés au moment du stimulus. Ici, la pupillométrie des changements de MP liés au stimulus est proposée comme méthode pour étudier les impacts comportementaux de divers types de déficience auditive dans des modèles animaux. En particulier, les protocoles de pupillométrie pour une utilisation chez les médecins généralistes, un modèle animal bien établi de divers types de pathologies auditives 50,51,52,53,54,55,56 (voir également la référence 57 pour une revue exhaustive) est décrit.

Bien que cette technique soit démontrée chez les médecins généralistes à audition normale, ces méthodes peuvent être facilement adaptées à d’autres modèles animaux et modèles animaux de diverses pathologies auditives. Il est important de noter que la pupillométrie peut être combinée avec d’autres mesures non invasives telles que l’EEG, ainsi qu’avec des enregistrements électrophysiologiques invasifs afin d’étudier les mécanismes sous-jacents aux éventuels déficits de détection et de perception du son. Enfin, cette approche peut également être utilisée pour établir de grandes similitudes entre les modèles humains et animaux.

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Protocol

Pour toutes les procédures expérimentales, obtenir l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) et respecter les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Aux États-Unis d’Amérique, les médecins généralistes sont en outre soumis à la réglementation du Département de l’agriculture des États-Unis (USDA). Toutes les procédures de ce protocole ont été approuvées par l’IACUC de l’Université de Pittsburgh et ont respecté les directives des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Pour cette expérience, trois médecins généralistes pigmentés mâles de type sauvage âgés de 4 à 10 mois, pesant ~ 600 à 1 000 g ont été utilisés.

1. Intervention chirurgicale

  1. Effectuer toutes les expériences de pupillométrie chez les médecins généralistes pigmentés éveillés, fixés sur la tête et à écoute passive. Vérifier l’audition normale chez les sujets expérimentaux à l’aide d’enregistrements de clic et de réponse auditive du tronc cérébral (ABR) à tons purs58.
    REMARQUE: Bien que l’acquisition de données pupillomométriques soit en soi non invasive, une chirurgie invasive post-implant de la tête est utilisée dans ce protocole pour immobiliser la tête de l’animal pendant la procédure. Les solutions de rechange sont présentées dans la section Discussion.
  2. Tout d’abord, implanter tous les animaux de laboratoire avec un poteau de tête en acier inoxydable pour la fixation de la tête sous anesthésie à l’isoflurane. Utiliser des techniques chirurgicales aseptiques pour ancrer le poteau de tête au crâne en utilisant une combinaison de vis osseuses et d’acrylique dentaire58.
  3. Fournir aux animaux des soins post-chirurgicaux, y compris l’administration d’analgésiques systémiques et topiques. Après une période de récupération de 2 semaines, acclimatez progressivement les animaux à la configuration expérimentale.
    NOTE: L’intervention chirurgicale est basée sur des méthodes précédemment publiées dans les GPs58 ainsi que dans d’autres espèces59,60, et n’est pas l’objet de ce protocole.

2. Acclimatation de l’animal au dispositif expérimental

REMARQUE : Les expériences ont généralement lieu dans une chambre ou une cabine insonorisée (voir le tableau des matériaux). Le temps nécessaire pour familiariser un animal à l’installation varie d’un sujet à l’autre. Les temps d’acclimatation typiques sont notés ci-dessous. Un animal bien acclimaté tolérera la fixation de la tête avec un minimum de mouvement corporel et entraînera de meilleures mesures du diamètre de la pupille.

  1. Après une période de récupération de 2 semaines, familiarisez d’abord les animaux à la manipulation et au transport (2-3 jours). Cette acclimatation est essentielle pour réduire le stress et l’anxiété. Pour familiariser l’animal à la manipulation, placez-le dans son conteneur de transport pendant de plus en plus de temps (10 à 30 minutes) et manipulez l’animal pendant de plus en plus de temps (10 à 30 minutes).
  2. Ensuite, acclimatez l’animal à la configuration expérimentale (2-3 jours) en plaçant l’animal dans un enclos pendant 10-45 min (Figure 1A). L’enclos doit permettre de petits changements posturaux pour le confort de l’animal pendant l’expérience. Permettre de petits changements posturaux pour le confort de l’animal pendant l’expérience. Cependant, on sait que la dilatation des pupilles précède le mouvement49. Par conséquent, mesurez le mouvement de l’animal et tenez compte de ce mouvement dans l’analyse des données (Figure 1C).
  3. Dans le cadre de cette acclimatation, manipulez manuellement le poteau de tête implanté, comme si l’animal allait être fixé la tête. Tenez le poteau de tête pendant des durées croissantes (10-60 s).
  4. Après l’acclimatation manuelle et en fonction du comportement de l’animal, essayez de fixer la tête de l’animal à un cadre rigide à l’aide du porte-implant.
  5. Augmentez lentement la durée de fixation de la tête (10-45 min) jusqu’à ce que l’animal soit calme et relativement immobile pendant qu’il est fixé sur la tête (2-3 jours).
  6. Habituez l’animal à la présence de la caméra, de la source de lumière IR et de la source de lumière blanche (1-2 jours). Allumez la lumière blanche, en augmentant progressivement la durée (10 min à 30 min).
  7. Habituez l’animal à la stimulation acoustique en jouant une variété de sons (p. ex., sons purs, clics, vocalisations) à différents niveaux sonores (1-2 jours, en même temps que l’étape 2.6). Pour minimiser l’accoutumance aux stimuli expérimentaux, utilisez des sons différents de ceux prévus pour les expériences de pupillométrie de cette étape.

3. Calibrage de la caméra pupillaire

REMARQUE: La caméra utilisée pour la pupillométrie émet une vidéo via USB vers la suite logicielle de pupillométrie. À partir de cette vidéo, le diamètre de la pupille est extrait à l’aide d’un ajustement de l’ellipse et d’une valeur seuil réglable par l’utilisateur par la suite logicielle de pupillométrie (voir Tableau des matériaux). Le logiciel s’interface ensuite avec une carte numérique-analogique. La carte émet une valeur de tension analogique proportionnelle au diamètre de la pupille. Un étalonnage est nécessaire pour convertir cette valeur de tension en diamètre de pupille en unités de longueur.

  1. Placez une feuille de papier contenant des images de disques noirs de diamètre connu au même endroit où l’œil du médecin généraliste sera situé pendant la pupillométrie. Pour les médecins généralistes, la est de l’ordre de 4 mm. Par conséquent, effectuez l’étalonnage à l’aide de disques de 3 mm, 4 mm et 5 mm.
  2. Placez la caméra de pupillométrie (voir le tableau des matériaux) à la même distance (25 cm) à laquelle les expériences seront effectuées. Ajustez l’ouverture et la mise au point de la caméra jusqu’à obtenir une image nette d’un disque de diamètre connu.
  3. Dans le logiciel d’acquisition de pupillométrie (voir Tableau des matériaux), ajustez le seuil de sorte que le contour de l’ellipse corresponde étroitement au disque imagé et notez la valeur de tension de sortie analogique et la mise à l’échelle.
  4. Répétez cette procédure pour les disques de 3 mm, 4 mm et 5 mm. Ensuite, tabulez les valeurs de diamètre réelles (en mm) correspondant aux valeurs de tension de sortie analogiques.

4. Acquisition de données pupillomemétriques

  1. Effectuez toutes les expériences dans une cabine ou une chambre insonorisée, avec les parois intérieures recouvertes de mousse anéchoïque.
  2. Pour la diffusion de stimuli en champ libre, montez un haut-parleur calibré sur la paroi de la chambre insonorisée, à une hauteur égale à la position où l’animal sera placé.
    NOTE: Le choix du haut-parleur dépend de l’espèce étudiée et des stimuli prévus. Pour les vocalisations GP, utilisez un haut-parleur haut-parleur pleine gamme qui a une réponse en fréquence relativement plate (±3 dB) dans la gamme de fréquences de vocalisation de 0,5 à 3 kHz (Figure 1A).
  3. Placez l’animal dans l’enclos en veillant à ce qu’il ne soit pas possible de faire de grands mouvements corporels (figure 1A). Fixez la tête de l’animal au cadre rigide tel que décrit à l’étape 2 (figure 1A).
  4. Placez un capteur piézoélectrique sous l’enclos afin de détecter et d’enregistrer les mouvements des animaux (figure 1A).
  5. Pour installer la bouffée d’air, utilisez un support fixé au dessus de la table pour placer une pointe de pipette à ~15 cm devant le museau de l’animal. Connectez un tube en silicium (~3 mm de diamètre) à l’extrémité de la pipette et connectez le tube à un cylindre d’air régulé.
  6. Maintenez la pression d’air du cylindre entre 20 et 25 psi. Passez le tube à travers une valve de pincement pour contrôler le moment et la durée de la bouffée d’air à l’aide d’un relais contrôlé par ordinateur.
  7. Illuminez l’œil avec un réseau de LED infrarouges placé à ~10 cm de distance. Utilisez un éclairage LED blanc à une intensité de ~2 000 cd/m2 pour éclairer l’œil imagé et amener le de base à ~3,5 mm. Maintenir des conditions d’éclairage constantes dans la chambre expérimentale tout au long des sessions expérimentales.
    REMARQUE: Dans un éclairage de laboratoire normal (~ 500 cd / m2), la pupille GP est assez dilatée et ne permet pas d’observer une dilatation supplémentaire liée au stimulus. En utilisant un éclairage supplémentaire, la pupille est amenée à un diamètre de base de ~3,5 mm, ce qui permet une plage dynamique suffisante pour observer la dilatation liée au stimulus. Cela garantit également des bases de référence cohérentes entre les sessions et les sujets.
  8. Ouvrez le logiciel d’acquisition de pupilles et acquérez la vidéo (à 90 ips) de la pupille à l’aide d’une caméra avec un objectif de 16 mm (résolution spatiale de 0,15° d’angle visuel) et un filtre infrarouge (IR) placé à une distance de 25 cm de l’œil imagé. Assurez-vous que l’œil est centré dans la zone imagée.
  9. Réglez l’ouverture et la mise au point de l’appareil photo, ainsi que le niveau IR jusqu’à ce que le contour de la pupille imagée soit net.
  10. Dans le logiciel d’acquisition de pupilles, définissez la zone d’intérêt contenant la pupille en sélectionnant une zone rectangulaire avec la souris.
  11. Utilisez le panneau de commande du logiciel d’acquisition des pupilles pour régler la luminosité et le contraste de la vidéo acquise. Réglez la densité de balayage sur 5 et ajustez le seuil de sorte que l’ajustement de l’ellipse corresponde étroitement au contour de la pupille dans la vidéo.
  12. À l’aide du logiciel du processeur d’interface neuronale, acquérir et enregistrer le signal analogique à partir de la trace, la trace de tension du capteur piézoélectrique enregistrant le mouvement, les temps de livraison du stimulus et les temps de livraison de la bouffée d’air.

5. Détection du bruit d’appel et discrimination catégorielle à l’aide d’un paradigme bizarre modifié

NOTE: Les stimuli pour les expériences de pupillométrie consistaient en des vocalisations de GP qui ont été enregistrées dans une colonie animale58. Les échantillons de vocalisation peuvent être trouvés dans le référentiel suivant: https://github.com/vatsunlab/CaviaVOX. En particulier, des cris sifflants et gémissants ont été utilisés pour obtenir les réponses des élèves indiquées dans les résultats représentatifs. Dans chaque catégorie, choisissez des vocalisations dont les longueurs sont approximativement égales. Pour tenir compte des différences dans l’amplitude d’enregistrement et les enveloppes temporelles des vocalisations, normalisez les vocalisations par leur amplitude quadratique moyenne (r.m.s.), si nécessaire.

  1. Présentez les stimuli auditifs à l’aide de MATLAB à une fréquence d’échantillonnage appropriée. Pour les médecins généralistes, qui sont des animaux entendants à basse fréquence, un taux d’échantillonnage de 100 kHz est suffisant.
  2. Sélectionnez huit exemples différents de vocalisations de GP de longueurs similaires parmi deux catégories différentes de vocalisations (par exemple, les appels de wheek et les appels de gémissement). Une catégorie (huit exemples) servira de stimuli standard, et l’autre catégorie (huit exemples) servira de stimuli bizarres ou déviants (Figure 2A).
  3. Pour générer des stimuli standard et déviants de 1 s de long intégrés dans le bruit à différents niveaux de rapport signal sur bruit (SNR), ajoutez un bruit blanc de longueur égale aux appels (bruit fermé). La plage de SNR échantillonnés dans cette expérience est comprise entre -24 dB SNR et +40 dB SNR.
  4. À l’aide d’un plan de bloc, dans chaque session expérimentale (~ 12 min), acquérir des données correspondant à un seul niveau SNR. Dans chaque session, utilisez huit exemples d’une catégorie de vocalisation à un SNR particulier comme stimuli standard, et huit exemples de l’autre catégorie de vocalisation à ce même niveau SNR comme stimuli déviants.
    REMARQUE: Un bloc expérimental typique dure ~ 12 minutes. Selon le comportement de l’animal et l’accoutumance des réponses des pupilles, il peut être possible d’acquérir des données pour 3-4 blocs chaque jour (~45 - 60 minutes). Pendant toute cette durée, surveillez l’animal de près via la vidéo de la pupille, la trace de mouvement, ainsi que directement entre les blocs.
  5. Pour chaque séance, préparez une séquence de présentation de stimulus pseudo-aléatoire qui contient des stimuli standard >90% du temps. Assurez-vous qu’entre les stimuli déviants, il y ait au moins 20 essais avec des stimuli standard (Figure 2B).
    REMARQUE: Selon l’expérience, l’ordre des stimuli déviants dans la séquence de présentation du stimulus peut adopter un design carré latin pour s’assurer que chaque stimulus déviant unique occupe une position séquentielle unique dans chaque session. La moyenne sur toutes les séances peut donc minimiser l’effet de la position de stimulus déviante dans la séquence de stimulus globale.
  6. Utilisez une intensité de stimulus fixe (par exemple, 85 dB SPL) pour toutes les présentations de stimulus.
    REMARQUE: Utilisez un convertisseur numérique-analogique approprié pour générer un signal audio, l’atténuer au niveau sonore souhaité à l’aide d’un atténuateur programmable, amplifier la puissance du signal et délivrer le signal à l’aide d’un haut-parleur étalonné (par exemple, matériel, voir Tableau des matériaux).
  7. Présenter les stimuli avec une grande régularité temporelle (1 s de stimulus suivi de 3 s de silence comme le montrent les résultats représentatifs).
    REMARQUE : Les réponses de dilatation des pupilles sont lentes, culminant généralement environ 1 s après le début du stimulus et prenant environ 5 s pour revenir à la ligne de base49. Le taux de présentation des stimuli doit être suffisamment bas pour tenir compte de ces lenteurs temporelles. La régularité temporelle est importante car il est possible que l’interruption du schéma temporel puisse elle-même agir comme un stimulus déviant.
  8. Pour maintenir l’engagement de l’animal avec les stimuli et minimiser l’accoutumance, éventuellement administrer une brève bouffée d’air (100 ms) après le stimulus déviant. S’assurer que le début de la bouffée d’air est suffisamment séparé de la durée du stimulus (2,5 s à partir du début du stimulus) pour que les réponses de dilatation des pupilles évoquées par le stimulus atteignent un pic avant que la bouffée d’air n’induise des artefacts de clignement.
    REMARQUE: Dans le paradigme classique de l’excentricité, aucun renforcement positif ou négatif n’est utilisé. Étant donné qu’une bouffée d’air est utilisée ici comme un renforcement légèrement aversif pour maintenir l’engagement de l’animal avec les stimuli auditifs, le paradigme est appelé paradigme bizarre modifié.

6. Analyse et statistiques

REMARQUE: Toutes les analyses ont été effectuées à l’aide de code personnalisé écrit en MATLAB (disponible à https://github.com/vatsunlab/GP_Pupil). Deux méthodes d’analyse principales sont décrites, qui traitent respectivement de la fiabilité et de l’évolution temporelle des réponses des élèves. Le choix de l’une ou des deux méthodes sera dicté par la conception expérimentale.

  1. Détection de mouvement et exclusion d’essai
    1. À l’aide du code pupil_avg_JOVE.m, effectuez une détection de mouvement et une exclusion d’essai pour chaque session. Pour ce faire, exécutez le code et sélectionnez le fichier de données à partir d’une seule session dans la boîte de dialogue contextuelle.
    2. Détendance linéaire de la trace et conversion des unités de tension en micromètres à l’aide de la table d’étalonnage dérivée précédemment (voir étape 3). En outre, détendance linéaire de la trace de mouvement sur toute la session d’enregistrement (~ 12 min).
    3. Inspectez les données de la séance en traçant la trace de la pupille (Figure 1B - rangée du haut) et la trace de mouvement décolorée linéairement (Figure 1B - rangée inférieure) sur la durée de la session (~12 min), superposées sur des marqueurs d’essai.
    4. Mesurez l’écart type (SD) du tracé de mouvement. Obtenez les temps des pics de trace de mouvement à l’aide de la fonction findpeaks de MATLAB. Considérons les pics qui ont franchi un seuil de 5 écart-types et qui sont séparés des autres pics d’au moins 1 s comme un événementde mouvement 49 (Figure 1B - en bas).
    5. Écarter tous les essais (standard et déviants) de dilatation de la pupille qui se produisent dans les 7 s suivant un événement de mouvement. Si plus de la moitié du nombre d’essais déviants est écarté en raison d’une dilatation pupillaire liée au mouvement, jetez toute la séance et répétez-la.
  2. Prétraitement et visualisation des données
    1. Utilisez le code pupil_avg_JOVE.m, pour supprimer les artefacts de clignement des yeux, prétraiter les données et obtenir la dilatation moyenne de la pupille à chaque stimulus au cours des séances. Pour ce faire, exécutez le code et sélectionnez tous les fichiers de données à analyser dans la boîte de dialogue contextuelle.
    2. Détectez les clignements oculaires (changements de supérieurs à 400 μm/ms) et supprimez-les en interpolant linéairement la trace dans une fenêtre de temps de 200 ms centrée sur le temps de clignement détecté. Écartez les données de séance si plus de la moitié du nombre d’essais déviants contiennent un clignement des yeux entre l’apparition du stimulus et l’apparition de la bouffée d’air.
    3. Sous-échantillonner les données à partir du taux d’échantillonnage d’acquisition de 1 000 Hz à 10 Hz.
    4. Extraire les traces de dans une fenêtre commençant 1 s avant le début du stimulus et durant 5 s après le décalage du stimulus. Calculez la moyenne de de base pour chaque stimulus dans une fenêtre de 500 ms juste avant le début du stimulus. Soustrayez la MP de base de ces traces pour obtenir le changement de DP évoqué par stimulus.
    5. Faire la moyenne des changements de MP évoqués par le stimulus pour chaque condition de stimulus à travers les séances chez chaque animal, puis entre les animaux pour générer la réponse moyenne de dilatation de la pupille à chaque condition de stimulus (par exemple, Figure 3A).
  3. Analyse de la courbe de croissance (GCA) pour quantifier l’évolution temporelle des changements de DP
    NOTE: Cette méthode d’analyse détermine l’ampleur et l’évolution temporelle des réponses de dilatation pupillaire et a été utilisée dans des études pupillométriques de sujets humains 27,36,40 ainsi que chez des cobayes 49.
    1. Concaténez verticalement toutes les sorties de pupil_avg_JOVE.m pour toutes les sessions, animaux, SNR et atténuations pour construire une matrice contenant les colonnes suivantes : animalID, SNR, niveau sonore et valeurs de diamètre Pupil (1-50). À l’aide du code pupil_LME_JOVE.m, effectuez l’analyse de la courbe de croissance (GCA)27,36,40,49.
    2. Ajuster les modèles linéaires à effets mixtes avec des interceptions au niveau du sujet en tant qu’effets aléatoires et des polynômes temporels orthogonaux d’ordre deux maximum en tant qu’effets fixes, chaque SNR déviant étant traité comme un groupe distinct, à la phase ascendante de la trace du diamètre de la pupille (0,1 à 2,1 s après le début du stimulus).
    3. Modélisez la phase montante de la trace pupillaire à l’aide de la formulesuivante 36,49 :
      Pupildilatation = (Intercept + Condition) + temps1 * (β temps1 + β temps1 : Condition) + temps2* (β temps2+ temps β 2 : Condition) + r(subjectlevelintercept)
      Où, temps1 et temps2 correspondent à des polynômes temporels linéaires et quadratiques orthogonaux, et βs correspondent à des poids.
    4. Estimez les poids moyens (βs) et leurs erreurs types à l’aide de la fonction fitlme de MATLAB. Estimer la signification statistique des poids à l’aide de la fonction coeftest.
    5. Pour chaque SNR, tracez les poids correspondant aux termes d’interception, linéaire et quadratique pour visualiser les résultats (Figure 3B, C).
  4. Analyse des essais montrant des dilatations pupillaires statistiquement significatives
    NOTE: Cette méthode d’analyse détermine la fraction d’essais déviants sur lesquels une réponse de dilatation pupillaire statistiquement significative est observée et correspond à la fiabilité des réponses de dilatation pupillaire.
    1. Choisissez une fenêtre d’analyse appropriée (0,5-1 s) centrée autour du pic de réponse de la pupille (généralement ~1,5 s après le début du stimulus). Calculez la MP moyenne dans cette fenêtre d’analyse pour tous les essais standard et déviants.
    2. Déterminer si la DP moyenne pour chacun des essais déviants est supérieure à 2,33 erreurs-types de la distribution combinée des valeurs moyennes de DP pour les essais standard. Compter les essais déviants qui dépassent ce seuil comme des essais montrant une dilatation significative de la pupille.
    3. Diviser le nombre d’essais sur les déviances montrant une dilatation significative des pupilles par le nombre total d’essais sur les déviances (pour chaque affection) afin de quantifier la fraction d’essais qui montrent des augmentations statistiquement significatives de la MP par rapport aux essais de stimulation standard.
    4. Mettez tout le pourcentage d’essais par session avec des changements significatifs de pupille dans chaque cellule d’un réseau de cellules, où les cellules sont disposées du SNR inférieur au SNR supérieur. À l’aide du code pupil_threshold_estimate_JOVE.m, estimez le seuil de catégorisation du bruit d’appel.
    5. Représenter la fraction des essais qui montrent une augmentation statistiquement significative de la MP en fonction de la RTS (Figure 3D). À ces données, utilisez la fonction fitnlm MATLAB (dans la boîte à outils statistiques) pour ajuster les fonctions psychométriques du formulaire61 :
      Ψ(x; α, β, λ) = (1 -λ) * F(x; α, β)
      Où, F est la fonction de Weibull, définie par
      F(x; α, β) = Equation 1, α est le paramètre de décalage, β est le paramètre de pente et λ est le taux de dérapage.

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Representative Results

La pupillométrie a été réalisée chez trois médecins généralistes pigmentés masculins, pesant ~ 600-1 000 g au cours des expériences. Comme décrit dans ce protocole, pour estimer les seuils de catégorisation du bruit d’appel, un paradigme bizarre a été utilisé pour la présentation des stimulus. Dans le paradigme bizarre, les appels appartenant à une catégorie (gémissements) intégrés dans le bruit blanc à un SNR donné ont été utilisés comme stimuli standard (Figure 2A), et les appels d’une autre catégorie (wheeks) intégrés dans le bruit blanc au même SNR (Figure 2A) que les stimuli déviants. Les stimuli standard et déviants ont été choisis au hasard, avec rééchantillonnage, parmi huit exemples de chaque catégorie. Dans chaque session expérimentale, les stimuli ont été présentés avec une régularité temporelle élevée (Figure 2B), avec au moins 20 présentations de stimuli standard entre des stimuli déviants. Des données correspondant à un niveau de SNR particulier ont été acquises à chaque session expérimentale. Au cours des sessions, un large éventail de SNR propres et bruyants ont été échantillonnés (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12, 40 dB SNR).

Les changements de DP aux stimuli standard ne différaient pas significativement de la ligne de base (ligne bleue dans la figure 3A). Les stimuli déviants ont évoqué des changements de DP robustes et significativement plus importants que ceux provoqués par les stimuli standard (lignes grises dans la figure 3A), reflétant la discrimination par catégorie d’appel. L’ampleur de la réponse et le pourcentage d’essais présentant des réponses pupillaires statistiquement significatives étaient les plus élevés au SNR le plus propre et diminuaient progressivement avec la diminution du SNR (Figure 3A,B). En utilisant GCA, les réponses des pupilles aux stimuli déviants se sont avérées statistiquement significatives à des SNR supérieurs à -18 dB (figure 3C), ce qui a été considéré comme le seuil de catégorisation du bruit d’appel (ligne verte dans la figure 3A). Le pourcentage d’essais significatifs à chaque niveau de SNR testé était bien ajusté par une fonction psychométrique (Figure 3D). Le niveau de SNR nécessaire pour atteindre le demi-maximum de la courbe psychométrique était d’environ -20 dB SNR (Figure 3D). De façon anecdotique, dans ce cas, les mesures basées sur la fiabilité et basées sur le parcours temporel ont donné des valeurs similaires de seuils de catégorisation des appels dans le bruit.

Figure 1
Figure 1 : Configuration de la pupillométrie et changements de DP évoqués par le stimulus et liés au mouvement. (A) La configuration pupillometry avec des images vidéo du son évoquant la dilatation de la pupille (en haut). La DP de base est représentée par des cercles verts en pointillés. (B) Un exemple de trace (en haut) et un exemple de trace de mouvement (en bas) d’une seule session expérimentale. Les lignes noires verticales correspondent aux présentations de stimulus déviant dans le temps d’apparition. Les coches rouges correspondent aux événements de mouvement détectés automatiquement. La ligne pointillée horizontale grise correspond au seuil de 5 écart-type. (C) Les changements de (ΔPD) évoqués par un stimulus déviant (en haut) et liés aux événements de mouvement (en bas) d’une session expérimentale. L’apparition du stimulus est indiquée par une ligne noire verticale; L’événement de détection de mouvement est indiqué par une ligne rouge verticale. Notez que l’apparition de la dilatation pupillaire précède l’apparition du mouvement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Spectrogrammes d’appel et structure du paradigme de catégorisation des appels dans le bruit. (A) Spectrogrammes représentatifs d’un cochon d’Inde gémissant, dans des conditions de propreté et à un SNR de 0 et -18 dB, respectivement. Les appels bruyants ont été obtenus en ajoutant du bruit blanc. (B) Structure du paradigme bizarre utilisé pour estimer les seuils de catégorisation des appels dans le bruit. Les cris de gémissements ont été choisis au hasard parmi huit exemples et utilisés comme stimuli standard. Les appels Wheek ont été choisis au hasard parmi huit exemplaires et utilisés comme déviants. Dans chaque session expérimentale, le bruit a été ajouté à un niveau SNR différent (-24, -18, -12, -6, -3, 0, 3, 6, 12 dB SNR). Les appels sont longs de 1 s et le temps entre les stimuli est de 3 s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Estimations pupillométries des détections de bruit d’appel et seuils de catégorisation. (A) Réponses moyennes des pupilles de trois animaux. Les réponses moyennes des pupilles aux stimuli de gémissement standard sont représentées par une ligne bleue, et l’ombrage correspond à ±1 erreur-type de moyenne (s.e.m.). Les lignes grises et les ombres correspondent à la moyenne et à ±1 s.e.m. des réponses pupillaires évoquées par des stimuli déviants. L’intensité de l’ombrage gris correspond au SNR. La ligne verte et l’ombrage correspondent à la trace moyenne de la pupille au seuil SNR (environ -18 dB SNR). La ligne verticale rouge correspond à l’apparition du stimulus; la ligne verticale orange correspond à l’apparition de la bouffée d’air; Les lignes pointillées sarcelle correspondent à la fenêtre GCA (change de phase ascendante). (B) GCA adapté à la phase croissante des changements de DP. Les points sont le diamètre moyen de la pupille dans les bacs temporels de 100 ms, les moustaches correspondent à ±1 s.e.m. Les lignes pleines correspondent aux ajustements de modèle à effets mixtes. Couleurs de ligne comme dans A. (C) Estimations de poids GCA. Les poids de l’interception sont en bleu, la pente est en rouge et l’accélération est en violet. Les moustaches correspondent à ±1 s.e.m. Les astérisques montrent des poids de régression statistiquement significatifs (test d’hypothèse linéaire sur les coefficients du modèle de régression linéaire). (D) La fonction psychométrique correspond au pourcentage d’essais présentant des changements significatifs de la MP provoqués par le stimulus déviant en fonction de la SNR. Les moustaches correspondent à ±1 s.e.m. Notez que 50% du maximum est atteint à environ -20 dB SNR (ligne pointillée verte). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole démontre l’utilisation de la pupillométrie comme méthode non invasive et fiable pour estimer les seuils auditifs chez les animaux à écoute passive. Conformément au protocole décrit ici, les seuils de catégorisation du bruit d’appel chez les médecins généralistes entendants normaux ont été estimés. Les seuils estimés par pupillométrie se sont avérés cohérents avec ceux obtenus à l’aide de la formation opérationnelle62. Cependant, par rapport à la formation opérationnelle, le protocole de pupillométrie était relativement simple et rapide à mettre en place et à acquérir des données. Chaque session d’acquisition de données (par niveau SNR) a duré environ 12 minutes, ce qui a donné lieu à 1-2 heures de sessions expérimentales (à travers les niveaux SNR) par animal et par jour49. L’acquisition des données pourrait être terminée en 7 à 10 jours environ (selon le nombre de niveaux de SNR utilisés). Bien que le paradigme oddball ait été utilisé pour l’estimation du seuil de catégorisation de l’appel dans le bruit dans ce manuscrit, ce protocole de pupillométrie peut être adapté à des versions plus faciles des paradigmes oddball, où un seul exemple d’appel est utilisé, ou à d’autres paradigmes de stimulus utilisant un large éventail de stimuli complexes ou simples49.

La méthode n’est pas sans inconvénients. Tout d’abord, le protocole actuel exige l’implantation d’un poteau de tête pour fixer la tête lors de ces expériences. La chirurgie post-implantaire de la tête et la récupération ajouteraient un minimum de 2 semaines au calendrier du protocole expérimental. Il est possible que cette étape puisse être évitée en utilisant d’autres méthodes d’immobilisation non invasive des animaux éveillés pendant les expériences, par exemple en utilisant des casques personnalisésimprimés en 3D 63 ou des thermoplastiques déformables64. D’autres expériences sont nécessaires pour explorer ces solutions. Deuxièmement, les animaux pourraient également s’habituer rapidement à des stimuli déviants, ce qui entraînerait une diminution des réponses de dilatation des pupilles au cours d’une séance expérimentale. Cet effet pourrait être minimisé en limitant les séances expérimentales à de courtes durées (~12 min) et en ne présentant qu’un nombre limité (8) de stimuli déviants. De plus, une bouffée d’air délivrée après les stimuli déviants peut garantir que les animaux restent engagés avec les stimuli auditifs. Troisièmement, en raison de cette accoutumance rapide, plusieurs jours peuvent être nécessaires pour compléter l’acquisition des données. En ne testant que les valeurs SNR qui échantillonnent de manière dense les parties les plus raides de la courbe psychométrique, le nombre total de jours expérimentaux peut être minimisé. Quatrièmement, les animaux peuvent ne pas rester immobiles pendant les expériences, ou cligner des yeux excessivement ou fermer les yeux pendant les expériences. Ces facteurs sont fonction de l’espèce et de l’acclimatation et montrent un degré élevé de variabilité individuelle. Les médecins généralistes sont naturellement dociles, et en les acclimatant bien à la configuration expérimentale, les artefacts de mouvement et de clignotement peuvent être minimisés. Les clignements spontanés et les saccades sont généralement assez rares chez les cobayes49, mais cela pourrait également être fonction de l’espèce. Enfin, comme mentionné précédemment, la dynamique des pupilles chez l’homme a été associée à un certain nombre de troubles neuropsychiatriques. Bien que les animaux de laboratoire utilisés ici soient supposés être neurotypiques, cette mise en garde doit être gardée à l’esprit lors de l’interprétation des résultats.

Bien qu’une implémentation matérielle de la pupillométrie soit décrite ici (à l’aide d’un oculomètre disponible dans le commerce et d’un système d’acquisition de données neuronales), l’équipement requis est coûteux et peu économique à mettre à l’échelle. Cependant, d’autres solutions personnalisées basées sur le même principe sous-jacent de suivi oculaire infrarouge et plus rentables sont disponibles. Par exemple, une étude a utilisé des composants personnalisés et des algorithmes de traitement vidéo personnalisés pour extraire le diamètre de la pupille de la vidéo enregistrée22,25. Des algorithmes d’apprentissage profond récemment développés sont également capables d’extraire le diamètre des pupilles à partir de données vidéographiques65,66. Ces solutions pourraient plus que réduire de moitié le coût des plates-formes de pupillométrie. Le compromis ici est entre les dépenses et le temps - alors que les solutions commerciales sont plus chères, ce sont des solutions clés en main qui peuvent être utilisées immédiatement. D’autre part, les solutions personnalisées sont rentables et évolutives, mais nécessitent une expertise pour être mises en place et le temps nécessaire pour développer des pipelines d’analyse personnalisés.

Bien que le protocole détaillé ici ait été effectué chez des médecins généralistes entendants normaux, la pupillométrie pourrait être relativement facile à utiliser dans d’autres modèles animaux de déficience auditive avec des changements appropriés au type et aux paramètres de stimulus. Cela permettrait de caractériser les effets de la perte auditive sur une gamme de types et d’espèces de stimulus, ce qui pourrait potentiellement donner lieu à de nouvelles observations. Étant donné que la pupillométrie est une technique non invasive qui a également été largement utilisée chez l’homme, en utilisant les mêmes stimuli utilisés pour les sujets animaux, la pupillométrie peut être utilisée pour comparer les effets de diverses pathologies auditives entre les espèces. Par exemple, une méta-analyse récente chez l’homme a montré que les déficits de perception de la parole dans le bruit résultant d’une exposition modérée au bruit étaient mieux observés lorsque des stimuli complexes et variant dans le temps étaient utilisés67. L’estimation des seuils de catégorisation du bruit d’appel par pupillométrie démontrée ici pourrait être utilisée comme une tâche de ce type en utilisant des stimuli complexes pour évaluer les effets de l’exposition au bruit chez les médecins généralistes. L’évaluation de l’audition au niveau comportemental à l’aide de ces méthodes compléterait les méthodes électrophysiologiques et anatomiques et pourrait faire partie de la boîte à outils standard pour évaluer divers troubles auditifs connus.

En conclusion, les points suivants sont essentiels pour une acquisition réussie des données pupillométries. Tout d’abord, pour assurer un rendement élevé des données, il est essentiel de bien familiariser les animaux avec la configuration expérimentale. Un manque de patience dans cette étape pourrait dégrader la qualité des données qui sont éventuellement obtenues ou nécessiter la répétition de plusieurs sessions pour rattraper les sessions perdues. Deuxièmement, pour éviter les changements de DP liés à la luminance, il est important d’effectuer des expériences dans des conditions d’éclairage constantes, en maintenant autant que possible ces conditions entre les sessions et les sujets. Troisièmement, pour minimiser le nombre de séances expérimentales nécessaires, il est important d’effectuer des expériences pilotes pour identifier les plages de paramètres critiques pour un échantillonnage dense. Quatrièmement, pour minimiser l’accoutumance des animaux aux stimuli, il est important d’effectuer des expériences en courtes sessions ne contenant que quelques présentations de stimuli déviants. Une bouffée d’air peut également être utilisée pour maintenir un engagement élevé avec les stimuli auditifs.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le NIH (R01DC017141), la Pennsylvania Lions Hearing Research Foundation et des fonds des départements d’otorhinolaryngologie et de neurobiologie de l’Université de Pittsburgh.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analog output board Measurement Computing Corporation, Norton, MA PCI-DDA02/12
Anechoic foam Sonex One, Pinta Acoustic, Minneapolis, MN
Condenser microphone Behringer, Willich, Germany C-2
Free-field microphone Bruel & Kjaer, Denmark)  Type 4940 
Matlab Mathworks, Inc., Natick, MA 2018a version
Monocular remote camera and illuminator system Arrington Research, Scottsdale, AZ MCU902 Infrared LED array + camera with infrared filter
Multifunction I/O Device  National Instruments, Austin, TX PCI-6229
Neural interface processor Ripple Neuro, Salt Lake City, UT SCOUT
Piezoelectric motion sensor SparkFun Electronics, Niwot, CO SEN-10293
Pinch valve  Cole-Palmer Instrument Co., Vernon Hills, IL EW98302-02
Programmable attenuator Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL PA5
Silicon Tubing Cole-Parmer ~3 mm
Sound attenuating chamber IAC Acoustics
Speaker full-range driver Tang Band Speaker, Taipei, Taiwan W4-1879
Stereo Amplifier Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL SA1
Tabletop - CleanTop Optical TMC vibration control / Ametek, Peabody, MA
Viewpoint software ViewPoint, Arrington Research, Scottsdale, AZ

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Neurosciences numéro 191
Pupillométrie pour évaluer la sensation auditive chez les cobayes
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Pernia, M., Kar, M., Montes-Lourido, P., Sadagopan, S. Pupillometry to Assess Auditory Sensation in Guinea Pigs. J. Vis. Exp. (191), e64581, doi:10.3791/64581 (2023).

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