Modèle murin spontané de cancer anaplasique de la thyroïde
Summary
Ici, nous présentons un pipeline standard pour obtenir des tumeurs ATC murines par des modèles murins spontanés génétiquement modifiés. En outre, nous présentons la dynamique tumorale et des informations pathologiques sur les lésions primaires et métastasées. Ce modèle aidera les chercheurs à comprendre la tumorigenèse et facilitera la découverte de médicaments.
Abstract
Le cancer anaplasique de la thyroïde (CTA) est une tumeur maligne rare mais mortelle dont le pronostic est sombre. Il est urgent de mener des recherches plus approfondies sur la cancérogenèse et le développement de l’ATC, ainsi que sur les méthodes thérapeutiques, car les traitements standard sont essentiellement épuisés chez les patients atteints d’ATC. Cependant, la faible prévalence a entravé les études cliniques approfondies et la collecte d’échantillons de tissus, de sorte que peu de progrès ont été réalisés dans la création de traitements efficaces. Nous avons utilisé le génie génétique pour créer un modèle murin ATC inductible conditionnellement (mATC) dans un arrière-plan C57BL/6. Le modèle murin ATC a été génotypé par TPO-cre/ERT2; BrafCA/poids; Trp53 ex2-10/ex2-10 et induit par injection intrapéritonéale de tamoxifène. Avec le modèle murin, nous avons étudié la dynamique tumorale (la taille de la tumeur variait de 12,4 mm 2 à 32,5 mm2 après 4 mois d’induction), la survie (la période de survie médiane était de 130 jours) et les métastases (métastases pulmonaires survenues chez 91,6% des souris) courbes et caractéristiques pathologiques (caractérisées par une coloration immunohistochimique Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 et Caspase-3). Les résultats ont indiqué que le mATC spontané possède une dynamique tumorale et un microenvironnement immunologique très similaires aux tumeurs ATC humaines. En conclusion, avec une grande similitude dans les caractéristiques physiopathologiques et les génotypes unifiés, le modèle mATC a résolu la pénurie de tissu ATC clinique et l’hétérogénéité des échantillons dans une certaine mesure. Par conséquent, il faciliterait le mécanisme et les études translationnelles de l’ATC et fournirait une approche pour étudier le potentiel de traitement des médicaments à petits molécules et des agents d’immunothérapie pour l’ATC.
Introduction
Le cancer de la thyroïde est l’une des tumeurs malignes endocriniennes les plus courantes1, provenant de l’épithélium thyroïdien. Ces dernières années, l’incidence du cancer de la thyroïde a augmenté rapidement dans le mondeentier 2. Le cancer de la thyroïde peut être divisé en types distincts en fonction du degré de différenciation des cellules tumorales. Sur la base du comportement clinique et de l’histologie, les carcinomes thyroïdiens sont divisés en carcinomes bien différenciés, y compris le carcinome papillaire de la thyroïde (PTC) et le carcinome folliculaire de la thyroïde (FTC), le carcinome peu différencié (PDTC) et le carcinome indifférencié ou anaplasique de la thyroïde (ATC)3. Contrairement au PTC, qui est un type commun avec un comportement doux et un meilleur pronostic4, l’ATC est une tumeur maligne rare et très agressive qui représente 2% à 3% de toutes les tumeurs thyroïdiennes5. Bien que l’ATC soit rare, il est responsable d’environ 50 % des décès liés au cancer de la thyroïde, avec une survie lamentable (6 à 8 mois)6,7. Plus de 50 % des cas d’ATC sont diagnostiqués comme des métastases pulmonaires8. En plus de la nature agressive de l’ATC, un traitement efficace limité a été développé en clinique. Par conséquent, les patients ATC ont un pronostic sombre 9,10,11. Cela suggère que d’autres études approfondies sont nécessaires de toute urgence sur les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement de l’ATC et du traitement.
La tumorigenèse de l’ATC est un processus dynamique dédifférencié. La difficulté de prélever des échantillons de tumeurs humaines à chaque étape des études cliniques a entravé la compréhension du mécanisme de développement des carcinomes bien différenciés aux carcinomes indifférenciés. En revanche, l’utilisation de modèles ATC murins (mATC) favorise la collecte d’échantillons de mATC dans l’ensemble du cours de tumorigenèse. Par conséquent, nous pouvons mieux comprendre les mécanismes de formation tumorale en analysant le processus dynamique dédifférencié. En outre, l’hétérogénéité des échantillons cliniques ATC a également contribué à la difficulté de comprendre le mécanisme moléculaire. Néanmoins, les souris partageaient les mêmes antécédents génétiques et étaient maintenues dans des environnements de vie similaires, assurant la cohérence de chaque tumeur. Cela facilite l’exploration du rôle généralisé du développement ATC12,13,14. De plus, le mATC est un modèle tumoral in situ qui peut restaurer l’influence de l’emplacement anatomique et du microenvironnement tissulaire spécifique. En tant que tel, comparé aux souris immunodéficientes couramment utilisées, le mATC est un modèle murin spontané avec un système immunitaire intact et un microenvironnement immunitaire.
Par conséquent, nous avons construit le mATC induit conditionnellement avec la souche C57BL/6, qui est un modèle murin capable de reproduire les caractéristiques pathologiques du carcinome thyroïdien dédifférencié. Sur la base de ce modèle, nous avons donné un bref aperçu de la base moléculaire, des idées de construction, des caractéristiques pathologiques et des applications du mATC. En outre, nous avons observé et rapporté la croissance tumorale, le temps de survie, les métastases et les caractéristiques pathologiques du mATC. Nous croyons qu’il s’agira d’un aperçu informatique pour aider d’autres chercheurs à utiliser ce modèle plus facilement.
Nous avons construit un modèle mATC inductible conditionnel, tel que rapporté pour la première fois par McFadden15 ; initialement, nous avons construit des souris : TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt et Trp53flox/wt. Plus précisément, les souris TPO-cre / ERT2 incluaient le promoteur de la peroxydase thyroïdienne humaine (TPO) (un promoteur spécifique de la thyroïde), entraînant l’expression d’un gène de fusion cre-ERT2 (une cre recombinase fusionnée à un domaine de ligand du récepteur des œstrogènes humains). Cre-ERT2 est généralement confiné au cytoplasme et ne pénètre dans le noyau que lorsqu’il est exposé au tamoxifène, ce qui induit le cre à exercer une activité enzymatique recombinante. Lorsque les souris sont croisées avec des souris portant des séquences flanquées de loxP, après induction de tamoxifène, la recombinaison médiée par la cré supprime les séquences floxées dans les cellules thyroïdiennes pour atteindre le but d’assommer ou de frapper dans des gènes spécifiques.
De plus, les souris Braf flox / poids sont un allèle knock-in de Braf humain basé sur le système cre-loxP. Le transcrit murin Brafflox/wt est codé par les exons endogènes 1-14 et les exons humains flanqués de loxP 15-18. Après excision médiée par la cre des régions floxées, l’exon 15 mutant (modifié par une substitution d’acides aminés V600E liée à BrafV600E constitutifment actif dans les cancers humains) et les exons endogènes 16-18 sont utilisés pour générer les transcrits. De plus, les souris Trp53 flox/poids sont des allèles knockout de Trp53 humain et ont des sites loxP flanquant les exons 2-10 de Trp53. Lorsqu’elle est croisée avec des souris avec une cre recombinase, la recombinaison médiée par cre supprime la séquence floxed pour éliminer Trp53. Ensuite, des souris TPO-cre/ERT2, Braf flox/w et Trp53flox/poids ont été croisées pour obtenir la tuberculose (TPO-cre/ERT2; Brafflox/poids) souris et TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/poids; Trp53flox/poids) souris, qui pourraient être utilisées pour générer PTC et ATC. Après environ 8 semaines, les souris ont été induites par une administration intrapéritonéale (i.p.) de 150 mg / kg de tamoxifène dissous dans de l’huile de maïs pendant deux administrations. La croissance tumorale a pu être surveillée par échographie à haute fréquence (le premier point temporel de l’échographie a été enregistré au jour 0). L’échographie initiale a été réalisée 40 jours après l’introduction du tamoxifène.
Protocol
Representative Results
Discussion
Étapes critiques du protocole de dissection tumorale thyroïdienne
Pendant la dissection, l’emplacement anatomique de la glande thyroïde doit être correctement compris. La glande thyroïde est une glande en forme de papillon située sur la face dorsale de la glande sous-maxillaire près du cartilage thyroïdien et de la trachée. Pendant la procédure, la sectionnement des artères sanguines des deux côtés du cou a été soigneusement évité.
Modification et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Programme national de développement de la recherche clé de la Chine (2021YFA1301203); la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); le projet d’incubation de recherche clinique, West China Hospital, Université du Sichuan (22HXFH019); le projet de coopération internationale du Bureau municipal de la science et de la technologie de Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fondation des sciences naturelles du Sichuan, 2022NSFSC1314; le « Projet 1.3.5 pour les disciplines d’excellence, Hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan » (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); et Programme des sciences et technologies du Sichuan (2023YFS0098).
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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