Спонтанная мышиная модель анапластического рака щитовидной железы
Summary
Здесь мы представляем стандартный конвейер для получения опухолей ATC у мышей с помощью спонтанных генетически модифицированных моделей мышей. Далее мы представляем опухолевую динамику и патологическую информацию о первичных и метастазирующих поражениях. Эта модель поможет исследователям понять онкогенез и облегчит открытие лекарств.
Abstract
Анапластический рак щитовидной железы (АТХ) является редким, но смертельным злокачественным новообразованием с мрачным прогнозом. Существует острая необходимость в более глубоких исследованиях канцерогенеза и развития АТХ, а также терапевтических методов, поскольку стандартные методы лечения у пациентов с АТХ практически исчерпаны. Однако низкая распространенность препятствовала тщательным клиническим исследованиям и сбору образцов тканей, поэтому в создании эффективных методов лечения был достигнут незначительный прогресс. Мы использовали генную инженерию для создания условно-индуцируемой мышиной модели ATC (mATC) на фоне C57BL/6. Мышиная модель ATC была генотипирована с помощью TPO-cre/ERT2; БрафCA/вес; Trp53 ex2-10/ex2-10 и индуцируется внутрибрюшинным введением тамоксифена. С помощью мышиной модели мы исследовали динамику опухоли (размер опухоли варьировал от 12,4 мм 2 до 32,5 мм2 после 4 месяцев индукции), выживаемость (средний период выживания составил 130 дней) и метастазирование (метастазы в легкие произошли у 91,6% мышей) кривые и патологические особенности (характеризуются иммуногистохимическим окрашиванием Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 и Caspase-3). Результаты показали, что спонтанная mATC обладает очень похожей на опухолевую динамику и иммунологическое микроокружение с опухолями ATC человека. В заключение, при высоком сходстве патофизиологических признаков и унифицированных генотипов, модель mATC в некоторой степени устранила нехватку клинической ткани ATC и гетерогенность образца. Таким образом, это облегчило бы механизм и трансляционные исследования АТХ и обеспечило бы подход к изучению лечебного потенциала низкомолекулярных препаратов и иммунотерапевтических агентов для АТХ.
Introduction
Рак щитовидной железы является одним из наиболее распространенных эндокринных злокачественных новообразований1, происходящих из эпителия щитовидной железы. В последние годы заболеваемость раком щитовидной железы быстро возросла во всем мире2. Рак щитовидной железы можно разделить на отдельные типы в зависимости от степени дифференцировки опухолевых клеток. На основании клинического поведения и гистологии карциномы щитовидной железы делятся на хорошо дифференцированные карциномы, включая папиллярную карциному щитовидной железы (ПТК) и фолликулярную карциному щитовидной железы (ФТК), низкодифференцированную карциному (ПДТК) и недифференцированную или анапластическую карциному щитовидной железы (АТХ)3. В отличие от ПТК, который является распространенным типом с легким поведением и лучшим прогнозом4, АТХ является редким и очень агрессивным злокачественным новообразованием, на долю которого приходится от 2% до 3% всех опухолей щитовидной железы5. Хотя АТХ встречается редко, он является причиной примерно 50% смертей, связанных с раком щитовидной железы, с удручающей выживаемостью (6-8 месяцев)6,7. Более 50% случаев АТХ диагностируются как метастазы в легкие8. Помимо агрессивного характера АТХ, в клинике разработано ограниченное эффективное лечение. Таким образом, пациенты с АТХ имеют мрачный прогноз 9,10,11. Это говорит о том, что срочно необходимы дальнейшие углубленные исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе разработки АТХ и лечения.
Онкогенез АТХ является динамическим дедифференцированным процессом. Сложность сбора образцов опухолей человека на каждом этапе клинических исследований препятствовала пониманию механизма развития от хорошо дифференцированных до недифференцированных карцином. Напротив, использование мышиных моделей АТХ (mATC) благоприятствует сбору образцов mATC во всем курсе онкогенеза. Таким образом, мы можем лучше понять механизмы образования опухоли, проанализировав динамический дедифференцированный процесс. Кроме того, гетерогенность клинических образцов АТХ также способствовала трудностям в понимании молекулярного механизма. Тем не менее, мыши имели одинаковый генетический фон и содержались в одинаковой среде обитания, обеспечивая консистенцию каждой опухоли. Это облегчает изучение обобщенной роли развития УВД12,13,14. Кроме того, mATC представляет собой модель опухоли in situ, которая может восстанавливать влияние анатомического расположения и тканеспецифического микроокружения. Таким образом, по сравнению с широко используемыми иммунодефицитными мышами, mATC представляет собой спонтанную мышиную модель с интактной иммунной системой и иммунным микроокружением.
Поэтому мы построили условно-индуцированный mATC со штаммом C57BL/6, который представляет собой мышиную модель, способную воспроизводить патологические особенности дедифференцированной карциномы щитовидной железы. Основываясь на этой модели, мы дали краткий обзор молекулярной основы, идей построения, патологических особенностей и приложений mATC. Кроме того, мы наблюдали и сообщали о росте опухоли, времени выживания, метастазировании и патологических особенностях mATC. Мы считаем, что это будет информационный обзор, который поможет другим исследователям легче использовать эту модель.
Мы построили условную индуцируемую модель mATC, о которой впервые сообщил McFadden15; Первоначально мы сконструировали мышей: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt и Trp53flox/wt. В частности, мыши TPO-cre / ERT2 включали промотор пероксидазы щитовидной железы человека (TPO) (специфический для щитовидной железы промотор), стимулирующий экспрессию гена слияния cre-ERT2 (рекомбиназа cre, слитая с лиганд-связывающим доменом рецептора эстрогена человека). Cre-ERT2 обычно ограничивается цитоплазмой и попадает в ядро только при воздействии тамоксифена, который побуждает cre проявлять активность рекомбинантного фермента. Когда мышей скрещивают с мышами, несущими loxP-фланкированные последовательности, после индукции тамоксифена кре-опосредованная рекомбинация удаляет флоксированные последовательности в клетках щитовидной железы для достижения цели нокаута или выбивания определенных генов.
Кроме того, мыши Braf flox / wt являются аллелем человеческого Braf, основанного на системе cre-loxP. Мышиный транскрипт Brafflox/wt кодируется эндогенными экзонами 1-14 и локсP-фланговыми человеческими экзонами 15-18. После кре-опосредованного иссечения флоксированных областей мутантный экзон 15 (модифицированный аминокислотной заменой V600E, связанной с конститутивно активным BrafV600E при раке человека) и эндогенные экзоны 16-18 используются для генерации транскриптов. Кроме того, мыши Trp53 flox / wt являются нокаутными аллелями человеческого Trp53 и имеют сайты loxP, фланкирующие экзоны 2-10 Trp53. При скрещивании с мышами с кре-рекомбиназой кре-опосредованная рекомбинация удаляет флоксированную последовательность, чтобы нокаутировать Trp53. Затем мышей TPO-cre/ERT2, Braf flox/w и Trp53flox/wt скрещивали для получения туберкулеза (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) мыши и TBP (TPO-cre/ERT2; Браф-флокс/вес; Trp53flox/вес) мышей, которые можно было бы использовать для генерации PTC и ATC. Примерно через 8 недель мышей индуцировали внутрибрюшинным (в/) введением 150 мг/кг тамоксифена, растворенного в кукурузном масле, в течение двух введений. Рост опухоли можно было контролировать с помощью высокочастотного ультразвукового исследования (первый момент времени УЗИ был зарегистрирован как день 0). Первичное УЗИ проводилось через 40 дней после введения тамоксифена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в протоколе вскрытия опухоли щитовидной железы
Во время рассечения нужно правильно понимать анатомическое расположение щитовидной железы. Щитовидная железа представляет собой железу в форме бабочки, расположенную на дорсальной стороне подчелюстной желе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной программой развития ключевых исследований Китая (2021YFA1301203); Национальный фонд естественных наук Китая (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); Инкубационный проект клинических исследований, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет (22HXFH019); Проект международного сотрудничества Муниципального научно-технического бюро Чэнду (2020-GH02-00017-HZ); Фонд естественных наук провинции Сычуань, 2022NSFSC1314; «Проект 1.3.5 по дисциплинам передового опыта, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет» (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); и Сычуаньская научно-техническая программа (2023YFS0098).
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O’Neill, J. P., Shaha, A. R. Anaplastic thyroid cancer. Oral Oncology. 49 (7), 702-706 (2013).
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D. Anaplastic thyroid cancer. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 37 (2), 525-538 (2008).
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -. C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -. P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -. S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
