Summary

Spontan murin model af anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen

Published: February 03, 2023
doi:

Summary

Her præsenterer vi en standard pipeline til opnåelse af murine ATC-tumorer ved spontane genetisk manipulerede musemodeller. Endvidere præsenterer vi tumordynamik og patologisk information om de primære og metastaserede læsioner. Denne model vil hjælpe forskere med at forstå tumorigenese og lette lægemiddelopdagelser.

Abstract

Anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen (ATC) er en sjælden, men dødelig malignitet med en dyster prognose. Der er et presserende behov for mere dybtgående forskning i kræftfremkaldende virkning og udvikling af ATC samt terapeutiske metoder, da standardbehandlinger i det væsentlige er udtømt hos ATC-patienter. Den lave prævalens har imidlertid hæmmet grundige kliniske undersøgelser og indsamling af vævsprøver, så der er kun gjort få fremskridt med at skabe effektive behandlinger. Vi brugte genteknologi til at skabe en betinget inducerbar ATC-murinmodel (mATC) i en C57BL/6-baggrund. ATC-murinmodellen blev genotypet af TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 og induceret ved intraperitoneal injektion med tamoxifen. Med murinmodellen undersøgte vi tumordynamikken (tumorstørrelse varierede fra 12,4 mm 2 til 32,5 mm2 efter 4 måneders induktion), overlevelse (medianoverlevelsesperioden var 130 dage) og metastaser (lungemetastaser forekom hos 91,6% af musene) kurver og patologiske træk (karakteriseret ved Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 og Caspase-3 immunhistokemisk farvning). Resultaterne viste, at spontan mATC besidder meget lignende tumordynamik og immunologisk mikromiljø til humane ATC-tumorer. Afslutningsvis, med høj lighed i patofysiologiske træk og forenede genotyper, løste mATC-modellen manglen på klinisk ATC-væv og prøveheterogenitet til en vis grad. Det vil derfor lette mekanismen og translationelle undersøgelser af ATC og give en tilgang til undersøgelse af behandlingspotentialet for små molekylære lægemidler og immunterapimidler til ATC.

Introduction

Kræft i skjoldbruskkirtlen er en af de mest almindelige endokrine maligniteter1, der stammer fra skjoldbruskkirtelepitelet. I de senere år er forekomsten af kræft i skjoldbruskkirtlen steget hurtigt på verdensplan2. Kræft i skjoldbruskkirtlen kan opdeles i forskellige typer i henhold til graden af tumorcelledifferentiering. På basis af klinisk adfærd og histologi er skjoldbruskkirtelkarcinomer opdelt i veldifferentierede karcinomer, herunder papillært skjoldbruskkirtelkarcinom (PTC) og follikulært skjoldbruskkirtelkarcinom (FTC), dårligt differentieret karcinom (PDTC) og udifferentieret eller anaplastisk karcinom i skjoldbruskkirtlen (ATC)3. I modsætning til PTC, som er en almindelig type med mild adfærd og bedre prognose4, er ATC en sjælden og meget aggressiv malignitet, der tegner sig for 2% til 3% af alle skjoldbruskkirteltumorer5. Selvom ATC er sjælden, er den ansvarlig for ca. 50% af skjoldbruskkirtelkræftrelaterede dødsfald med dyster overlevelse (6-8 måneder)6,7. Over 50% af ATC tilfælde diagnosticeres som lungemetastase8. Ud over ATC’s aggressive karakter er der udviklet begrænset effektiv behandling i klinikken. Derfor har ATC-patienter en dyster prognose 9,10,11. Dette tyder på, at der er et presserende behov for yderligere dybtgående undersøgelser af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af ATC og behandling.

Tumorigenesen af ATC er en dynamisk dedifferentieret proces. Vanskeligheden ved at indsamle humane tumorprøver på hvert trin i kliniske undersøgelser har hindret forståelsen af udviklingsmekanismen fra veldifferentierede til udifferentierede karcinomer. I modsætning hertil favoriserer brugen af murine ATC-modeller (mATC) indsamlingen af mATC-prøver i hele tumorigeneseforløbet. Derfor kan vi bedre forstå mekanismerne for tumordannelse ved at analysere den dynamiske dedifferentierede proces. Derudover har heterogeniteten af kliniske ATC-prøver også bidraget til vanskeligheden ved at forstå den molekylære mekanisme. Ikke desto mindre delte mus den samme genetiske baggrund og blev opretholdt i lignende levende miljøer, hvilket sikrede hver tumors konsistens. Dette letter udforskningen af ATC-udviklingens generaliserede rolle12,13,14. Derudover er mATC en in situ tumormodel, der kan genoprette indflydelsen af den anatomiske placering og vævsspecifikke mikromiljø. Som sådan, sammenlignet med almindeligt anvendte immundefekte mus, er mATC en spontan murinmodel med et intakt immunsystem og immunmikromiljø.

Derfor konstruerede vi betinget induceret mATC med C57BL/6-stammen, som er en murinmodel, der er i stand til at reproducere de patologiske træk ved dedifferentieret skjoldbruskkirtelkarcinom. Baseret på denne model gav vi et kort overblik over det molekylære grundlag, konstruktionsideer, patologiske træk og anvendelser af mATC. Derudover observerede og rapporterede vi tumorvækst, overlevelsestid, metastase og patologiske træk ved mATC. Vi mener, at dette vil være et informatisk overblik for at hjælpe andre forskere med at bruge denne model lettere.

Vi konstruerede en betinget inducerbar mATC-model, som først rapporteret af McFadden15; oprindeligt konstruerede vi mus: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt og Trp53flox/wt. Specifikt inkluderede TPO-cre / ERT2-mus den humane thyroidperoxidase (TPO) promotor (en skjoldbruskkirtelspecifik promotor), der drev ekspressionen af et cre-ERT2-fusionsgen (en cre-rekombinase, der er smeltet sammen med et humant østrogenreceptorligandbindingsdomæne). Cre-ERT2 er normalt begrænset til cytoplasmaet og kommer kun ind i kernen, når den udsættes for tamoxifen, hvilket inducerer cre til at udøve rekombinant enzymaktivitet. Når musene krydses med mus, der bærer loxP-flankerede sekvenser, sletter cre-medieret rekombination efter tamoxifen-induktion de floxede sekvenser i skjoldbruskkirtelcellerne for at opnå formålet med at slå ud eller banke specifikke gener ind.

Derudover er Braf flox/wt-mus en knock-in-allel af human Braf baseret på cre-loxP-systemet. Brafflox/wt murine transkript er kodet af endogene exons 1-14 og loxP-flankeret humane exons 15-18. Efter cre-medieret excision af de floxede regioner anvendes den mutante exon 15 (modificeret med en V600E-aminosyresubstitution forbundet med konstitutivt aktiv BrafV600E i humane kræftformer) og de endogene exoner 16-18 til at generere transkripterne. Desuden er Trp53 floks / wt-mus knockout-alleler af human Trp53 og har loxP-steder, der flankerer exons 2-10 af Trp53. Når den krydses med mus med en cre-rekombinase, sletter cre-medieret rekombination den floxede sekvens for at slå Trp53 ud. Derefter blev TPO-cre/ERT2, Braf flox/w og Trp53flox/wt mus krydset for at opnå TB (TPO-cre/ERT2; Braffloks/vægt) mus og TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflok/vægt; Trp53flox/vægt) mus, som kunne bruges til at generere PTC og ATC. Efter ca. 8 uger blev musene induceret ved en intraperitoneal (i.p.) administration af 150 mg/kg tamoxifen opløst i majsolie til to administrationer. Tumorvækst kunne overvåges ved højfrekvent ultralyd (det første tidspunkt for ultralyd blev registreret som dag 0). Indledende ultralyd blev udført 40 dage efter tamoxifen introduktion.

Protocol

De dyreforsøg, der er beskrevet her, blev udført med godkendelse fra Animal Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, Kina. 1. Induktion af TBP-mus Identificer mus genotypeOmkring 3 uger adskilles hunmusene fra hanmusene. Brug samtidig øremærkeklemme til at fastgøre et øremærke. Placer øremærkerne i den nederste halvdel og på den midterste tredjedel af øret, og sørg for at undgå området med den højeste konce…

Representative Results

Vi inducerede mATC til at undersøge tumorvækst, museoverlevelsestid og patologiske egenskaber. Efter induktion blev musene straks ofret, og prøver (skjoldbruskkirtel, lunge og lever) blev indsamlet, når en af følgende tilstande blev fundet: 1) åndedrætsbesvær forårsaget af tumorkompression; 2) nedsat appetit og unormal vokalisering; 3) usædvanlig sløvhed; og 4) vægttab på over 20%. Under prøvetagningsprocessen fandt vi, at alle mus (12/12) med succes dannede tumorer efter induktion. Vi registrerede musens o…

Discussion

Kritiske trin inden for protokollen for dissektion af skjoldbruskkirteltumor
Under dissektion skal den anatomiske placering af skjoldbruskkirtlen forstås korrekt. Skjoldbruskkirtlen er en sommerfuglformet kirtel placeret på den dorsale side af den submandibulære kirtel nær skjoldbruskkirtlen brusk og luftrøret. Under proceduren blev det omhyggeligt undgået at skære blodarterierne på begge sider af halsen.

Ændring og fejlfinding af mATC-racen
ATC…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af National Key Research Development Program of China (2021YFA1301203); National Natural Science Foundation of China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); det kliniske forskningsinkubationsprojekt, West China Hospital, Sichuan University (22HXFH019); det internationale samarbejdsprojekt fra Chengdu Municipal Science and Technology Bureau (2020-GH02-00017-HZ); Naturvidenskabelig stiftelse af Sichuan, 2022NSFSC1314; “1.3.5-projektet for ekspertisediscipliner, West China Hospital, Sichuan University” (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); og Sichuan Science and Technology Program (2023YFS0098).

Materials

100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) MXB Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) ZSGB-GIO Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3 Beyotime Cat# AC033
CD8 Cell Signaling Technology Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206 Cell Signaling Technology Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit MXB Cat# DAB-2031
Eosin staining solution ZSGB-GIO Cat# ZLI-9613
F4/80 Abcam Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3 Cell Signaling Technology Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator Leica Biosystems ASP300S
Hematoxylin staining solution ZSGB-GIO Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine Leica Biosystems
Ki67 Beyotime Cat# AF1738
Rotating Slicer RWDlifescience  Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) ZSGB-GIO Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd JY92-IIN
Ultrasound gel Keppler KL-250
Ultrasound system VisualSonics Vevo 3100

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
  3. Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
  4. Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
  5. O’Neill, J. P., Shaha, A. R. Anaplastic thyroid cancer. Oral Oncology. 49 (7), 702-706 (2013).
  6. Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
  7. Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
  8. Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D. Anaplastic thyroid cancer. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 37 (2), 525-538 (2008).
  9. Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
  10. Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
  11. Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -. C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
  12. Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
  13. Charles, R. -. P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
  14. Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
  15. McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
  16. Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
  17. He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
  18. Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
  19. Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
  20. Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
  21. Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
  22. Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
  23. Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
  24. Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
  25. Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
  26. Huang, N. -. S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
  27. Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
  28. Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
check_url/kr/64607?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Yan, H., Ma, Y., Zhou, X., He, Y., Liu, Y., Caulin, C., Wang, L., Xu, H., Luo, H. Spontaneous Murine Model of Anaplastic Thyroid Cancer. J. Vis. Exp. (192), e64607, doi:10.3791/64607 (2023).

View Video