Modelo murino espontáneo de cáncer anaplásico de tiroides
Summary
Aquí, presentamos una tubería estándar para obtener tumores murinos ATC mediante modelos espontáneos de ratón genéticamente modificados. Además, presentamos la dinámica tumoral y la información patológica sobre las lesiones primarias y metastástasis. Este modelo ayudará a los investigadores a comprender la tumorigénesis y facilitar los descubrimientos de fármacos.
Abstract
El cáncer anaplásico de tiroides (ATC) es una neoplasia maligna rara pero letal con un pronóstico sombrío. Existe una necesidad urgente de una investigación más profunda sobre la carcinogénesis y el desarrollo de ATC, así como métodos terapéuticos, ya que los tratamientos estándar se agotan esencialmente en pacientes con ATC. Sin embargo, la baja prevalencia ha obstaculizado estudios clínicos exhaustivos y la recolección de muestras de tejido, por lo que se ha avanzado poco en la creación de tratamientos efectivos. Utilizamos ingeniería genética para crear un modelo murino ATC condicionalmente inducible (mATC) en un fondo C57BL/6. El modelo murino ATC fue genotipado por TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 e inducido por inyección intraperitoneal con tamoxifeno. Con el modelo murino, investigamos la dinámica tumoral (el tamaño del tumor varió de 12,4 mm 2 a 32,5 mm2 después de 4 meses de inducción), la supervivencia (la mediana del período de supervivencia fue de 130 días) y metástasis (las metástasis pulmonares ocurrieron en el 91,6% de los ratones) curvas y características patológicas (caracterizadas por tinción inmunohistoquímica Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 y Caspasa-3). Los resultados indicaron que el mATC espontáneo posee una dinámica tumoral y un microambiente inmunológico muy similares a los tumores ATC humanos. En conclusión, con una alta similitud en las características fisiopatológicas y genotipos unificados, el modelo mATC resolvió la escasez de tejido clínico ATC y la heterogeneidad de la muestra hasta cierto punto. Por lo tanto, facilitaría el mecanismo y los estudios traslacionales de ATC y proporcionaría un enfoque para investigar el potencial de tratamiento de fármacos moleculares pequeños y agentes de inmunoterapia para ATC.
Introduction
El cáncer de tiroides es una de las neoplasias endocrinas más comunes1, que se origina en el epitelio tiroideo. En los últimos años, la incidencia de cáncer de tiroides ha aumentado rápidamente en todo el mundo2. El cáncer de tiroides se puede dividir en distintos tipos según el grado de diferenciación de las células tumorales. Sobre la base del comportamiento clínico y la histología, los carcinomas de tiroides se dividen en carcinomas bien diferenciados, incluyendo carcinoma papilar de tiroides (PTC) y carcinoma folicular de tiroides (FTC), carcinoma pobremente diferenciado (PDTC) y carcinoma indiferenciado o anaplásico de tiroides (ATC)3. A diferencia del PTC, que es un tipo común con comportamiento leve y mejor pronóstico4, el ATC es una neoplasia maligna rara y altamente agresiva que representa del 2% al 3% de todos los tumores tiroideos5. Aunque el ATC es raro, es responsable de aproximadamente el 50% de las muertes relacionadas con el cáncer de tiroides, con una supervivencia sombría (6-8 meses)6,7. Más del 50% de los casos de ATC se diagnostican como metástasis pulmonar8. Además de la naturaleza agresiva del ATC, se ha desarrollado un tratamiento efectivo limitado en la clínica. Por lo tanto, los pacientes con ATC tienen un pronóstico sombrío 9,10,11. Esto sugiere que se necesitan urgentemente más estudios en profundidad sobre los mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo del ATC y el tratamiento.
La tumorigénesis del ATC es un proceso dinámico desdiferenciado. La dificultad para recolectar muestras de tumores humanos en cada etapa de los estudios clínicos ha dificultado la comprensión del mecanismo de desarrollo de carcinomas bien diferenciados a indiferenciados. En contraste, el uso de modelos murinos de ATC (mATC) favorece la recolección de muestras de mATC en todo el curso de la tumorigénesis. Por lo tanto, podemos comprender mejor los mecanismos de formación de tumores analizando el proceso dinámico desdiferenciado. Además, la heterogeneidad de las muestras clínicas de ATC también ha contribuido a la dificultad de comprender el mecanismo molecular. Sin embargo, los ratones compartían los mismos antecedentes genéticos y se mantuvieron en entornos de vida similares, asegurando la consistencia de cada tumor. Esto facilita explorar el papel generalizado del desarrollo de ATC12,13,14. Además, mATC es un modelo tumoral in situ que puede restaurar la influencia de la ubicación anatómica y el microambiente específico del tejido. Como tal, en comparación con los ratones inmunodeficientes de uso común, mATC es un modelo murino espontáneo con un sistema inmune intacto y un microambiente inmune.
Por lo tanto, construimos mATC inducido condicionalmente con la cepa C57BL/6, que es un modelo murino capaz de reproducir las características patológicas del carcinoma tiroideo desdiferenciado. Con base en este modelo, dimos una breve descripción de las bases moleculares, ideas de construcción, características patológicas y aplicaciones de mATC. Además, observamos e informamos el crecimiento tumoral, el tiempo de supervivencia, la metástasis y las características patológicas de mATC. Creemos que esta será una visión general informática para ayudar a otros investigadores a usar este modelo más fácilmente.
Construimos un modelo mATC inducible condicional, como se informó por primera vez en McFadden15; inicialmente, construimos ratones: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt y Trp53flox / wt. Específicamente, los ratones TPO-cre / ERT2 incluyeron el promotor de la peroxidasa tiroidea humana (TPO) (un promotor específico de la tiroides), impulsando la expresión de un gen de fusión cre-ERT2 (una recombinasa cre fusionada a un dominio de unión al ligando del receptor de estrógeno humano). Cre-ERT2 generalmente se limita al citoplasma y entra en el núcleo solo cuando se expone al tamoxifeno, que induce a cre a ejercer actividad enzimática recombinante. Cuando los ratones se cruzan con ratones portadores de secuencias flanqueadas por loxP, después de la inducción de tamoxifeno, la recombinación mediada por cre elimina las secuencias floxed en las células tiroideas para lograr el propósito de eliminar o golpear genes específicos.
Además, los ratones Braf flox/wt son un alelo knock-in de Braf humano basado en el sistema cre-loxP. La transcripción murina Brafflox/wt está codificada por los exones endógenos 1-14 y los exones humanos flanqueados por loxP 15-18. Después de la escisión mediada por cre de las regiones floxed, el exón mutante 15 (modificado con una sustitución de aminoácidos V600E vinculada con BrafV600E constitutivamente activo en cánceres humanos) y los exones endógenos 16-18 se utilizan para generar las transcripciones. Además, los ratones Trp53 flox/wt son alelos knockout de Trp53 humano y tienen sitios loxP flanqueando los exones 2-10 de Trp53. Cuando se cruza con ratones con una recombinasa cre, la recombinación mediada por cre elimina la secuencia floxed para eliminar Trp53. Luego, se cruzaron ratones TPO-cre/ERT2, Braf flox/w y Trp53flox/wt para obtener TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) ratones y TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) ratones, que podrían usarse para generar PTC y ATC. Después de aproximadamente 8 semanas, los ratones fueron inducidos por una administración intraperitoneal (i.p.) de 150 mg / kg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz durante dos administraciones. El crecimiento tumoral podría controlarse mediante ecografía de alta frecuencia (el primer punto de tiempo de la ecografía se registró como el Día 0). La ecografía inicial se realizó 40 días después de la introducción del tamoxifeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pasos críticos dentro del protocolo para la disección de tumores tiroideos
Durante la disección, la ubicación anatómica de la glándula tiroides debe entenderse correctamente. La glándula tiroides es una glándula en forma de mariposa ubicada en el lado dorsal de la glándula submandibular cerca del cartílago tiroides y la tráquea. Durante el procedimiento, se evitó cuidadosamente cortar las arterias sanguíneas en ambos lados del cuello.
Modificación y so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Desarrollo de Investigación Clave de China (2021YFA1301203); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); el Proyecto de Incubación de Investigación Clínica, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (22HXFH019); el Proyecto de Cooperación Internacional de la Oficina Municipal de Ciencia y Tecnología de Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fundación de Ciencias Naturales de Sichuan, 2022NSFSC1314; el “1.3.5 proyecto para disciplinas de excelencia, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan” (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); y Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2023YFS0098).
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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