Eencellige analyse van de expressie van Pseudomonas syringae-genen in het plantenweefsel
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode die eencellige genexpressieanalyse mogelijk maakt op Pseudomonas syringae-populaties die in de apoplast van de plant worden gekweekt.
Abstract
Een overvloed aan pathogene micro-organismen vallen voortdurend planten aan. Het Pseudomonas syringae-soortencomplex omvat Gram-negatieve plantpathogene bacteriën van bijzonder belang voor een groot aantal gastheren. P. syringae komt de plant binnen vanaf het bladoppervlak en vermenigvuldigt zich snel binnen de apoplast en vormt microkolonies die de intercellulaire ruimte bezetten. De constitutieve expressie van fluorescerende eiwitten door de bacteriën maakt visualisatie van de microkolonies mogelijk en monitoring van de ontwikkeling van de infectie op microscopisch niveau. Recente ontwikkelingen in eencellige analyse hebben de grote complexiteit aangetoond die wordt bereikt door klonale isogene bacteriële populaties. Deze complexiteit, fenotypische heterogeniteit genoemd, is het gevolg van cel-tot-cel verschillen in genexpressie (niet gekoppeld aan genetische verschillen) tussen de bacteriële gemeenschap. Om de expressie van individuele loci op eencellig niveau te analyseren, zijn transcriptionele fusies met fluorescerende eiwitten op grote schaal gebruikt. Onder stressomstandigheden, zoals die optreden tijdens de kolonisatie van de apoplast van de plant, differentieert P. syringae in verschillende subpopulaties op basis van de heterogene expressie van belangrijke virulentiegenen (d.w.z. het Hrp type III-secretiesysteem). Eencellige analyse van een bepaalde P. syringae-populatie hersteld uit plantenweefsel is echter een uitdaging vanwege het cellulaire puin dat vrijkomt tijdens de mechanische verstoring die inherent is aan de inentings- en bacteriële extractieprocessen. Het huidige rapport beschrijft een methode die is ontwikkeld om de expressie van P. syringae-genen van belang op eencellig niveau te volgen tijdens de kolonisatie van Arabidopsis en bonenplanten. De bereiding van de planten en de bacteriële suspensies die worden gebruikt voor inenting met behulp van een vacuümkamer worden beschreven. Het herstel van endofytische bacteriën uit geïnfecteerde bladeren door apoplastische vloeistofextractie wordt hier ook uitgelegd. Zowel de bacteriële inentings- als de bacteriële extractiemethoden zijn empirisch geoptimaliseerd om schade aan planten en bacteriële cellen te minimaliseren, wat resulteert in bacteriële preparaten die optimaal zijn voor microscopie en flowcytometrie-analyse.
Introduction
Pathogene bacteriën vertonen verschillen in verschillende fenotypen, wat aanleiding geeft tot de vorming van subpopulaties binnen genetisch identieke populaties. Dit fenomeen staat bekend als fenotypische heterogeniteit en is voorgesteld als een aanpassingsstrategie tijdens interacties tussen bacteriënen gastheer 1. Recente ontwikkelingen in de optische resolutie van confocale microscopen, flowcytometrie en microfluïdica, gecombineerd met fluorescerende eiwitten, hebben eencellige analyses van bacteriële populaties bevorderd2.
De Gram-negatieve Pseudomonas syringae is een archetypische plantpathogene bacterie vanwege zowel zijn academische als economische belang3. De levenscyclus van P. syringae is gekoppeld aan de watercyclus4. P. syringae komt de intercellulaire ruimtes tussen de mesofylcellen, de apoplast van het plantenblad, binnen via natuurlijke openingen zoals huidmondjes of wonden5. Eenmaal in de apoplast vertrouwt P. syringae op het type III-secretiesysteem (T3SS) en de type III-getransloceerde effectoren (T3E) om de immuniteit van planten te onderdrukken en de cellulaire functies van planten te manipuleren ten behoeve van de ziekteverwekker6. De expressie van T3SS en T3E is afhankelijk van de hoofdregulator HrpL, een alternatieve sigmafactor die zich bindt aan de hrp-boxmotieven in het promotorgebied van dedoelgenen 7.
Door chromosoom-gelokaliseerde transcriptionele fusies te genereren naar fluorescerende eiwitgenen stroomafwaarts van het gen van belang, kan men genexpressie volgen op basis van de fluorescentieniveaus die worden uitgezonden op het niveau van één cel8. Met behulp van deze methode is vastgesteld dat de expressie van hrpL heterogeen is, zowel binnen bacterieculturen die in het laboratorium worden gekweekt als binnen bacteriepopulaties die zijn hersteld uit de plant apoplast 8,9. Hoewel genexpressieanalyse op eencellig niveau meestal wordt uitgevoerd in bacterieculturen die in laboratoriummedia worden gekweekt, kunnen dergelijke analyses ook worden uitgevoerd op bacteriepopulaties die in de plant groeien, waardoor waardevolle informatie wordt verkregen over de vorming van subpopulaties in de natuurlijke context. Een mogelijke beperking voor de analyse van bacteriële populaties die uit de plant worden geëxtraheerd, is dat klassieke inentingsmethoden door infiltratie van de spuitdruk in de apoplast, gevolgd door bacteriële extractie door maceratie van het bladweefsel, meestal een grote hoeveelheid cellulair plantenresten genereren die de stroomafwaartse analyse verstoort10. Het meeste cellulaire puin bestaat uit autofluorescerende fragmenten van chloroplasten die overlappen met GFP-fluorescentie, wat resulteert in misleidende resultaten.
Het huidige protocol beschrijft het proces van het analyseren van heterogeniteit van eencellige genexpressie in twee modelpathosystemen: die gevormd door de P. syringae pv. tomatenstam DC3000 en Arabidopsis thaliana (Col-0), en de andere door de P. syringae pv. phaseolicola stam 1448A en bonenplanten (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Een inentingsmethode wordt voorgesteld op basis van vacuüminfiltratie met behulp van een vacuümkamer en een pomp, wat resulteert in een snelle en schadevrije methode om hele bladeren te infiltreren. Bovendien wordt, als een verbetering van conventionele protocollen, een zachtere methode gebruikt om de bacteriële populatie uit de apoplast te extraheren die weefselverstoring aanzienlijk vermindert, gebaseerd op de extractie van apoplastische vloeistof door cycli van positieve en negatieve druk toe te passen met behulp van een kleine hoeveelheid volume in een spuit.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methode beschrijft een niet-invasieve procedure die de infiltratie van bacteriën in het bladweefsel van planten mogelijk maakt, waardoor de snelle inenting van grote volumes mogelijk is en tegelijkertijd weefselverstoring wordt geminimaliseerd. Een van de kenmerken van het P. syringae-soortencomplex is het vermogen om te overleven en zich te vermenigvuldigen in de plantenapoplast en op het plantoppervlak als epifyt14. De mogelijkheid dat de bacteriën die volgens h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door projectsubsidie RTI2018-095069-B-I00, gefinancierd door MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ en door “ERDP: A way of making Europe”. J.S.R. werd gefinancierd door Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. werd gefinancierd door Project Grant P18-RT-2398 van Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
- Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
- Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
- Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
- Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
- Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
- Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
- Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
- Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
- Huber, P. J. . Robust Statistics. , (1981).
- Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
- Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
- Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
- Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
- O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
