הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המאפשרת ניתוח ביטוי גנים של תא בודד על אוכלוסיות מזרקי Pseudomonas הגדלות בתוך אפופלסט הצמח.
שפע של מיקרואורגניזמים פתוגניים תוקפים כל הזמן צמחים. קומפלקס מיני מזרקי Pseudomonas כולל חיידקים גראם-שליליים צמחיים-פתוגניים בעלי רלוונטיות מיוחדת למספר רב של פונדקאים. מזרקי P . נכנסים לצמח מפני השטח של העלה ומתרבים במהירות בתוך האפופלסט, ויוצרים מיקרו-מושבות המאכלסות את החלל הבין-תאי. הביטוי המכונן של חלבונים פלואורסצנטיים על ידי החיידקים מאפשר הדמיה של המיקרוקולוניות ומעקב אחר התפתחות הזיהום ברמה המיקרוסקופית. ההתקדמות האחרונה באנליזה של תא בודד חשפה את המורכבות הגדולה שאליה מגיעות אוכלוסיות חיידקים איזוגניים משובטים. מורכבות זו, המכונה הטרוגניות פנוטיפית, היא תוצאה של הבדלים בין תאים בביטוי גנים (שאינם קשורים להבדלים גנטיים) בקרב קהילת החיידקים. כדי לנתח את הביטוי של אתרים בודדים ברמת התא היחיד, נעשה שימוש נרחב באיחוי שעתוק לחלבונים פלואורסצנטיים. בתנאי עקה, כמו אלה המתרחשים במהלך קולוניזציה של אפופלסט הצמח, מזרקי P. מתמיינים לתת-אוכלוסיות נפרדות בהתבסס על ביטוי הטרוגני של גנים אלימים מרכזיים (כלומר, מערכת ההפרשה מסוג Hrp III). עם זאת, ניתוח חד-תאי של כל אוכלוסיית מזרקי P . נתונה שהתאוששה מרקמת הצמח הוא מאתגר בשל הפסולת התאית המשתחררת במהלך השיבוש המכני המהותי לתהליכי החיסון ומיצוי החיידקים. הדו”ח הנוכחי מפרט שיטה שפותחה כדי לעקוב אחר ביטוי של גנים בעלי עניין של P. syringae ברמת התא הבודד במהלך ההתיישבות של Arabidopsis וצמחי שעועית. מתוארים הכנת הצמחים והתרחיפים החיידקיים המשמשים לחיסון באמצעות תא ואקום. ההתאוששות של חיידקים אנדופיטיים מעלים נגועים על ידי מיצוי נוזל אפופלסטי מוסברת גם כאן. הן שיטות החיסון החיידקי והן שיטות מיצוי החיידקים ממוטבות אמפירית כדי למזער את הנזק לצמחים ולתאי חיידקים, וכתוצאה מכך ההכנות החיידקיות אופטימליות למיקרוסקופיה ולניתוח ציטומטריית זרימה.
חיידקים פתוגניים מציגים הבדלים בפנוטיפים מגוונים, מה שגורם להיווצרות תת-אוכלוסיות בתוך אוכלוסיות זהות גנטית. תופעה זו ידועה בשם הטרוגניות פנוטיפית והוצעה כאסטרטגיית הסתגלות במהלך אינטראקציות חיידקים-מארחים1. ההתקדמות האחרונה ברזולוציה האופטית של מיקרוסקופים קונפוקליים, ציטומטריית זרימה ומיקרופלואידיקה, בשילוב עם חלבונים פלואורסצנטיים, טיפחה אנליזות חד-תאיות של אוכלוסיות חיידקים2.
מזרקי Pseudomonas גראם-שליליים הם חיידקים פתוגניים צמחיים ארכיטיפיים בשל חשיבותם האקדמית והכלכלית3. מחזור החיים של מזרקי P. קשור למחזור המים4. מזרקי P. נכנסים לחללים הבין-תאיים שבין תאי המזופיל, אפופלסט עלה הצמח, דרך פתחים טבעיים כגון פיוניות או פצעים5. ברגע שהוא בתוך האפופלסט, מזרקי P. מסתמכים על מערכת ההפרשה מסוג III (T3SS) ועל המשפיעים המועתקים מסוג III (T3E) כדי לדכא את חסינות הצמח ולתפעל את תפקודי התא הצמחי לטובת הפתוגן6. הביטוי של T3SS ו-T3E תלוי בווסת הראשי HrpL, גורם סיגמא חלופי הנקשר למוטיבים של תיבת HRP באזור המקדם של גני המטרה7.
על ידי יצירת איחוי שעתוק הממוקם בכרומוזומים לגנים חלבוניים פלואורסצנטיים במורד הזרם של הגן המעניין, ניתן לעקוב אחר ביטוי גנים בהתבסס על רמות הפלואורסצנטיות הנפלטות ברמת התא הבודד8. בשיטה זו נקבע כי ביטוי HRPL הוא הטרוגני הן בתרביות חיידקים הגדלות במעבדה והן באוכלוסיות חיידקים שנמצאו מהצמח אפופלסט 8,9. למרות שניתוח ביטוי גנים ברמת התא הבודד מבוצע בדרך כלל בתרביות חיידקים הגדלות באמצעי מעבדה, ניתוחים כאלה יכולים להתבצע גם על אוכלוסיות חיידקים הגדלות בתוך הצמח, ובכך לספק מידע רב ערך על היווצרות תת-אוכלוסיות בהקשר הטבעי. מגבלה פוטנציאלית לניתוח אוכלוסיות חיידקים המופקות מהצמח היא ששיטות חיסון קלאסיות על ידי חדירת לחץ מזרק לאפופלסט, ואחריה מיצוי חיידקים על ידי השרייה של רקמת העלה, מייצרות בדרך כלל כמות גדולה של פסולת צמחית תאית המפריעה לניתוח במורד הזרם10. רוב פסולת התא מורכבת מקטעים אוטופלואורסצנטיים של כלורופלסטים החופפים לפלואורסצנטיות GFP, והתוצאה היא תוצאות מטעות.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את תהליך ניתוח ההטרוגניות של ביטוי גנים חד-תאיים בשתי מערכות מודל: זו שנוצרה על ידי מזרקי P. pv. זן עגבניות DC3000 ו Arabidopsis thaliana (Col-0), והשני על ידי P. מזרקים pv. זן פאזוליקולה 1448A וצמחי שעועית (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). שיטת חיסון מוצעת המבוססת על חדירת ואקום באמצעות תא ואקום ומשאבה, וכתוצאה מכך שיטה מהירה ונטולת נזקים לחדירת עלים שלמים. יתר על כן, כשיפור לפרוטוקולים הקונבנציונליים, משתמשים בשיטה עדינה יותר למיצוי אוכלוסיית החיידקים מהאפופלסט המפחיתה באופן משמעותי את הפרעה הרקמות, המבוססת על מיצוי נוזל אפופלסטי על ידי הפעלת מחזורים של לחץ חיובי ושלילי באמצעות כמות קטנה של נפח בתוך מזרק.
השיטה המוצגת כאן מתארת הליך לא פולשני המאפשר חדירת חיידקים לרקמת העלווה של הצמח, ומאפשר חיסון מהיר של נפחים גדולים תוך מזעור הפרעה לרקמות. אחד המאפיינים של קומפלקס מיני מזרקי P . הוא היכולת לשרוד ולהתרבות בתוך אפופלסט הצמח ועל פני הצמח כאפיפיט14. לפיכך, לא ניתן לשלול את האפ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענק RTI2018-095069-B-I00 במימון MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ ועל ידי “ERDP דרך לעשות אירופה”. J.S.R. מומן על ידי Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. מומן על ידי פרויקט Grant P18-RT-2398 מ-Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
10 cm diameter pots | No special requirements | ||
140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
20 mL syringe | No special requirements | ||
50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
Agarose | Merk | ||
Ampicillin sodium | GoldBio | ||
Bacteriological agar | Roko | ||
Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
Fiji software | |||
Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
MgCl2 | Merk | ||
NaCl | Merk | ||
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
Plant substrate | No special requirements | ||
Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
Toothpicks | No special requirements | ||
Tryptone | Merk | ||
Tweezers | No special requirements | ||
Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
Vermiculite | No special requirements | ||
Yeast Extract | Merk |