Summary

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

Published: October 06, 2022
doi:

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המאפשרת ניתוח ביטוי גנים של תא בודד על אוכלוסיות מזרקי Pseudomonas הגדלות בתוך אפופלסט הצמח.

Abstract

שפע של מיקרואורגניזמים פתוגניים תוקפים כל הזמן צמחים. קומפלקס מיני מזרקי Pseudomonas כולל חיידקים גראם-שליליים צמחיים-פתוגניים בעלי רלוונטיות מיוחדת למספר רב של פונדקאים. מזרקי P . נכנסים לצמח מפני השטח של העלה ומתרבים במהירות בתוך האפופלסט, ויוצרים מיקרו-מושבות המאכלסות את החלל הבין-תאי. הביטוי המכונן של חלבונים פלואורסצנטיים על ידי החיידקים מאפשר הדמיה של המיקרוקולוניות ומעקב אחר התפתחות הזיהום ברמה המיקרוסקופית. ההתקדמות האחרונה באנליזה של תא בודד חשפה את המורכבות הגדולה שאליה מגיעות אוכלוסיות חיידקים איזוגניים משובטים. מורכבות זו, המכונה הטרוגניות פנוטיפית, היא תוצאה של הבדלים בין תאים בביטוי גנים (שאינם קשורים להבדלים גנטיים) בקרב קהילת החיידקים. כדי לנתח את הביטוי של אתרים בודדים ברמת התא היחיד, נעשה שימוש נרחב באיחוי שעתוק לחלבונים פלואורסצנטיים. בתנאי עקה, כמו אלה המתרחשים במהלך קולוניזציה של אפופלסט הצמח, מזרקי P. מתמיינים לתת-אוכלוסיות נפרדות בהתבסס על ביטוי הטרוגני של גנים אלימים מרכזיים (כלומר, מערכת ההפרשה מסוג Hrp III). עם זאת, ניתוח חד-תאי של כל אוכלוסיית מזרקי P . נתונה שהתאוששה מרקמת הצמח הוא מאתגר בשל הפסולת התאית המשתחררת במהלך השיבוש המכני המהותי לתהליכי החיסון ומיצוי החיידקים. הדו”ח הנוכחי מפרט שיטה שפותחה כדי לעקוב אחר ביטוי של גנים בעלי עניין של P. syringae ברמת התא הבודד במהלך ההתיישבות של Arabidopsis וצמחי שעועית. מתוארים הכנת הצמחים והתרחיפים החיידקיים המשמשים לחיסון באמצעות תא ואקום. ההתאוששות של חיידקים אנדופיטיים מעלים נגועים על ידי מיצוי נוזל אפופלסטי מוסברת גם כאן. הן שיטות החיסון החיידקי והן שיטות מיצוי החיידקים ממוטבות אמפירית כדי למזער את הנזק לצמחים ולתאי חיידקים, וכתוצאה מכך ההכנות החיידקיות אופטימליות למיקרוסקופיה ולניתוח ציטומטריית זרימה.

Introduction

חיידקים פתוגניים מציגים הבדלים בפנוטיפים מגוונים, מה שגורם להיווצרות תת-אוכלוסיות בתוך אוכלוסיות זהות גנטית. תופעה זו ידועה בשם הטרוגניות פנוטיפית והוצעה כאסטרטגיית הסתגלות במהלך אינטראקציות חיידקים-מארחים1. ההתקדמות האחרונה ברזולוציה האופטית של מיקרוסקופים קונפוקליים, ציטומטריית זרימה ומיקרופלואידיקה, בשילוב עם חלבונים פלואורסצנטיים, טיפחה אנליזות חד-תאיות של אוכלוסיות חיידקים2.

מזרקי Pseudomonas גראם-שליליים הם חיידקים פתוגניים צמחיים ארכיטיפיים בשל חשיבותם האקדמית והכלכלית3. מחזור החיים של מזרקי P. קשור למחזור המים4. מזרקי P. נכנסים לחללים הבין-תאיים שבין תאי המזופיל, אפופלסט עלה הצמח, דרך פתחים טבעיים כגון פיוניות או פצעים5. ברגע שהוא בתוך האפופלסט, מזרקי P. מסתמכים על מערכת ההפרשה מסוג III (T3SS) ועל המשפיעים המועתקים מסוג III (T3E) כדי לדכא את חסינות הצמח ולתפעל את תפקודי התא הצמחי לטובת הפתוגן6. הביטוי של T3SS ו-T3E תלוי בווסת הראשי HrpL, גורם סיגמא חלופי הנקשר למוטיבים של תיבת HRP באזור המקדם של גני המטרה7.

על ידי יצירת איחוי שעתוק הממוקם בכרומוזומים לגנים חלבוניים פלואורסצנטיים במורד הזרם של הגן המעניין, ניתן לעקוב אחר ביטוי גנים בהתבסס על רמות הפלואורסצנטיות הנפלטות ברמת התא הבודד8. בשיטה זו נקבע כי ביטוי HRPL הוא הטרוגני הן בתרביות חיידקים הגדלות במעבדה והן באוכלוסיות חיידקים שנמצאו מהצמח אפופלסט 8,9. למרות שניתוח ביטוי גנים ברמת התא הבודד מבוצע בדרך כלל בתרביות חיידקים הגדלות באמצעי מעבדה, ניתוחים כאלה יכולים להתבצע גם על אוכלוסיות חיידקים הגדלות בתוך הצמח, ובכך לספק מידע רב ערך על היווצרות תת-אוכלוסיות בהקשר הטבעי. מגבלה פוטנציאלית לניתוח אוכלוסיות חיידקים המופקות מהצמח היא ששיטות חיסון קלאסיות על ידי חדירת לחץ מזרק לאפופלסט, ואחריה מיצוי חיידקים על ידי השרייה של רקמת העלה, מייצרות בדרך כלל כמות גדולה של פסולת צמחית תאית המפריעה לניתוח במורד הזרם10. רוב פסולת התא מורכבת מקטעים אוטופלואורסצנטיים של כלורופלסטים החופפים לפלואורסצנטיות GFP, והתוצאה היא תוצאות מטעות.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את תהליך ניתוח ההטרוגניות של ביטוי גנים חד-תאיים בשתי מערכות מודל: זו שנוצרה על ידי מזרקי P. pv. זן עגבניות DC3000 ו Arabidopsis thaliana (Col-0), והשני על ידי P. מזרקים pv. זן פאזוליקולה 1448A וצמחי שעועית (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). שיטת חיסון מוצעת המבוססת על חדירת ואקום באמצעות תא ואקום ומשאבה, וכתוצאה מכך שיטה מהירה ונטולת נזקים לחדירת עלים שלמים. יתר על כן, כשיפור לפרוטוקולים הקונבנציונליים, משתמשים בשיטה עדינה יותר למיצוי אוכלוסיית החיידקים מהאפופלסט המפחיתה באופן משמעותי את הפרעה הרקמות, המבוססת על מיצוי נוזל אפופלסטי על ידי הפעלת מחזורים של לחץ חיובי ושלילי באמצעות כמות קטנה של נפח בתוך מזרק.

Protocol

1. הכנת הצמח הכינו צמחי Arabidopsis Col-0 לפי השלבים הבאים.ממלאים עציץ בקוטר 10 ס”מ בתערובת מצע ורמיקוליט-צמח ביחס 1:3 (ראו טבלת חומרים), שהושקה בעבר, ומכסים את העציץ ברשת מתכת בגודל 15X15 ס”מ עם חורים בגודל 1.6 מ”מ x 1.6 מ”מ. התאימו את רשת המתכת לאדמה הרטובה באמצעות גומייה (<strong class="xf…

Representative Results

ביטוי מערכת ההפרשה מסוג III חיוני לצמיחת חיידקים בתוך הצמח. הביטוי בזמן של גנים T3SS מושג באמצעות ויסות מורכב, שבמרכזו גורם הסיגמה של הפונקציה החוץ-ציטופלזמית (ECF) HrpL, המפעיל העיקרי של ביטוי גנים הקשורים ל- T3SS11. ניתוח הביטוי של hrpL בוצע בעבר באמצעות איחוי שעתוק הממוקם כרומוזום ?…

Discussion

השיטה המוצגת כאן מתארת הליך לא פולשני המאפשר חדירת חיידקים לרקמת העלווה של הצמח, ומאפשר חיסון מהיר של נפחים גדולים תוך מזעור הפרעה לרקמות. אחד המאפיינים של קומפלקס מיני מזרקי P . הוא היכולת לשרוד ולהתרבות בתוך אפופלסט הצמח ועל פני הצמח כאפיפיט14. לפיכך, לא ניתן לשלול את האפ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענק RTI2018-095069-B-I00 במימון MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ ועל ידי “ERDP דרך לעשות אירופה”. J.S.R. מומן על ידי Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. מומן על ידי פרויקט Grant P18-RT-2398 מ-Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

Materials

0.17 mm coverslip No special requirements
1.6 x 1.6 mm metal mesh Buzifu Fiberglass screen mesh
10 cm diameter pots No special requirements
140 mm Petri dishes No special requirements
20 mL syringe No special requirements
50 mL conical tubes Sarstedt
Agarose Merk
Ampicillin sodium GoldBio
Bacteriological agar Roko
Confocal Microscope Stellaris Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer BD Biosciences
Fiji software
Gentamycin sulfate Duchefa G-0124
Kanamycin monosulfate Phytotechnology K378
MgCl2 Merk
NaCl Merk
Parafilm Pechiney Plastic Packaging
Plant substrate No special requirements
Silwet L-77 Cromton Europe Ltd
Toothpicks No special requirements
Tryptone Merk
Tweezers No special requirements
Vacuum chamber 25 cm diameter Kartell 554
Vacuum pump GAST DOA-P504-BN
Vermiculite No special requirements
Yeast Extract Merk

References

  1. Weigel, W. A., Dersch, P. Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy. Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).
  2. Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277 (2021).
  3. Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
  4. Morris, C. E., et al. The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).
  5. Rufián, J. S., et al. Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains. Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).
  6. Macho, A. P. Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity. New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).
  7. Xiao, Y., Hutcheson, S. W. A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae. Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).
  8. Rufián, J. S., et al. Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae. Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).
  9. Rufian, J. S., et al. Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host. Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).
  10. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. Arabidopsis Book. 1, 0039 (2002).
  11. Fouts, D. E., et al. Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).
  12. Huber, P. J. . Robust Statistics. , (1981).
  13. Freed, N. E., et al. A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise. PLoS Genetics. 4 (12), 1000307 (2008).
  14. Hirano, S. S., Upper, C. D. Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).
  15. Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization. Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).
  16. Liu, X., et al. Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (104), e53364 (2015).
  17. O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example. Journal of Visualized Experiments. (94), e52113 (2014).
  18. Tornero, P., Dangl, J. L. A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).
check_url/kr/64614?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Rufián, J. S., López-Pagán, N., Ruiz-Albert, J., Beuzón, C. R. Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue. J. Vis. Exp. (188), e64614, doi:10.3791/64614 (2022).

View Video