進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植
Summary
このプロトコルは免疫不全のマウスの盲腸壁の患者得られた癌細胞の同所性移植を記述する。このモデルは、進行した大腸がんの転移性疾患を再現し、肺および肝臓転移の臨床的に関連するシナリオにおける新しい治療薬の評価を可能にします。
Abstract
過去10年間で、患者由来のがん細胞と3D腫瘍様を用いて、より洗練された前臨床大腸がん(CRC)モデルが確立されてきました。患者由来の腫瘍オルガノイドは元の腫瘍の特徴を保持できるため、これらの信頼性の高い前臨床モデルにより、がん治療薬のスクリーニングや薬剤耐性メカニズムの研究が可能になります。しかしながら、患者における大腸がん関連死は、主に転移性病変の存在と関連している。したがって、ヒトのがん転移の主要な分子的特徴を真に再現する関連する in vivo モデルで抗がん療法の有効性を評価することが不可欠です。大腸がん由来のがん細胞をマウスの盲腸壁に直接注入した同所性モデルを確立しました。これらの腫瘍細胞は盲腸に原発腫瘍を発症し、肝臓や肺に転移し、進行した大腸がん患者によくみられる。このCRCマウスモデルは、患者の原発腫瘍または転移を容易に特定できる臨床的に関連する小規模イメージング法であるマイクロコンピューター断層撮影法(μCT)によってモニターされる薬物反応を評価するために使用できます。ここでは、免疫不全マウスの盲腸壁に患者由来のがん細胞を移植するための手術手順と必要な方法論について説明します。
Introduction
大腸がん(CRC)は、世界のがんによる死亡原因の第2位です1。個々の患者の腫瘍細胞に由来するin vitroまたはin vivoの腫瘍モデルを生成する能力は、腫瘍学における精密医療を進歩させてきました。過去10年間で、患者由来オルガノイド(PDO)または異種移植片(PDX)は、世界中の多くの研究グループによって使用されてきました2。PDOは、元の腫瘍組織の特徴に似た多細胞in vitro構造であり、自己組織化および自己複製が可能です3。これらの有望なin vitroモデルは、薬物スクリーニングやトランスレーショナルリサーチの促進にうまく使用できます。一方、PDXモデルは、組織学から分子形質、薬物反応まで、関連するすべてのレベルで元のCRCを忠実に再現しています2,4。
生体内 PDXモデルは、主に免疫不全マウスの皮下腫瘍として増殖します。このアプローチにより、PDXはがん研究、特に薬剤感受性や耐性の研究においてゴールドスタンダードとなっています。しかしながら、大腸がん関連死は、肝臓、肺、または腹腔における転移性病変の存在とほとんどが関連しており、2つのアプローチ(PDOまたはPDX)のいずれも、進行した臨床環境を再現することはできない。さらに、腫瘍増殖の特定の部位は、薬効や疾患の予後に影響を与える重要な生物学的特性を決定することが示されています2。したがって、臨床的に関連する転移性設定における抗がん剤の有効性を評価するために使用できる前臨床モデルを確立することが急務です6。
マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)スキャナーは、縮小された臨床用CTスキャナーとして機能し、がん患者のCT画像に比例したスケーリングされた画像解像度でマウスの原発腫瘍および転移画像を提供することができます7。μCT技術による軟部組織のコントラストの悪さを打ち消すために、放射線ヨウ素化造影剤を使用してコントラストを改善し、腫瘍量を評価することができます。二重造影アプローチを使用して、経口および腹腔内ヨウ素を異なるタイミングで投与します。経口投与される造影剤は、腫瘍組織と腸内の盲腸含有量との間の限界を定義するのに役立ちます。 他方では、腹腔内に投与された造影剤は、頻繁に増殖して腹膜に浸潤する腫瘍塊の外部限界の同定を可能にする8。
この論文では、免疫不全マウスの盲腸壁に患者由来のがん細胞を同所性移植するためのプロトコルと、μCTスキャンを使用して腸管腫瘍の増殖をモニターする方法について説明しています。本稿は、このモデルが、PDOまたはPDXOモデルを使用して研究できないCRC患者における進行性腸腫瘍および転移性疾患の臨床シナリオを再現していることを示しています。大腸がんの同所性PDXモデルは大腸がん患者の臨床シナリオを再現しているため、進行した腸腫瘍および転移性疾患における抗腫瘍薬の有効性を検証するためのこれまでの最良のモデルであると結論付けた。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去数十年にわたり、多くの新しい抗がん療法が開発され、大腸がん(CRC)を含むさまざまな種類の腫瘍の患者でテストされてきました。前臨床モデルでは多くの症例で有望な結果が観察されているが、進行性転移性CRC患者における治療効果はしばしば制限されている。したがって、臨床的に関連する転移シナリオで新しい治療薬の有効性をテストできる前臨床モデルが緊急に必要とされてい?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellex Foundation、CIBERONCネットワーク、Instituto de Salud Carlos IIIの支援に感謝します。さらに、実験が行われたVall d’Hebron Research Institute(VHIR)の前臨床イメージングプラットフォームにも感謝します。
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
