생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.
Summary
이 프로토콜은 면역 결핍 마우스의 맹장벽에 환자 유래 암세포의 orthotopic 이식을 설명합니다. 이 모델은 진행성 대장암 전이성 질환을 요약하고 폐 및 간 전이에 대한 임상적으로 관련된 시나리오에서 새로운 치료 약물을 평가할 수 있도록 합니다.
Abstract
지난 10년 동안 환자 유래 암세포와 3D 종양체를 사용하여 보다 정교한 전임상 대장암(CRC) 모델이 확립되었습니다. 환자 유래 종양 오가노이드는 원래 종양의 특성을 유지할 수 있기 때문에 이러한 신뢰할 수 있는 전임상 모델을 통해 항암제 스크리닝 및 약물 내성 메커니즘 연구를 수행할 수 있습니다. 그러나 환자의 CRC 관련 사망은 대부분 전이성 질환의 존재와 관련이 있습니다. 따라서 인간 암 전이의 주요 분자적 특징을 진정으로 재현하는 관련 in vivo 모델에서 항암 요법의 효능을 평가하는 것이 필수적입니다. CRC 환자 유래 암세포를 마우스의 맹장벽에 직접 주입하는 것을 기반으로 한 orthotopic 모델을 구축했습니다. 이 종양 세포는 간과 폐로 전이되는 맹장에서 원발성 종양을 발생시키며, 이는 진행성 CRC 환자에서 자주 관찰됩니다. 이 CRC 마우스 모델은 환자의 원발성 종양 또는 전이를 쉽게 식별할 수 있는 임상적으로 관련된 소규모 이미징 방법인 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT)으로 모니터링되는 약물 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스의 맹장 벽에 환자 유래 암세포를 이식하는 수술 절차와 필요한 방법론을 설명합니다.
Introduction
대장암(CRC)은 전 세계적으로 암 사망의 두 번째 주요 원인입니다1. 개별 환자 종양 세포에서 파생된 체외 또는 생체 내 종양 모델을 생성할 수 있는 능력은 종양학 분야의 정밀 의학을 발전시켰습니다. 지난 10년 동안 환자 유래 오가노이드(PDO) 또는 이종이식(PDX)은 전 세계의 많은 연구 그룹에서 사용되었습니다2. PDO는 원래 종양 조직의 특징과 유사한 다세포 체외 구조로, 자가 조직화와 자가 재생이 가능하다3. 이러한 유망한 in vitro 모델은 약물 스크리닝 및 중개 연구 촉진에 성공적으로 사용될 수 있습니다. 반면, PDX 모델은 조직학에서 분자 형질 및 약물 반응 2,4에 이르기까지 모든 관련 수준에서 원래의 CRC를 충실하게 재현합니다.
생체 내 PDX 모델은 대부분 면역 결핍 마우스에서 피하 종양으로 성장합니다. 이 접근법을 사용하여 PDX는 암 연구, 특히 약물 민감도 또는 내성 연구에서 황금 표준이 되었습니다. 그러나 CRC 관련 사망은 대부분 간, 폐 또는 복막강의 전이성 병변의 존재와 관련이 있으며, 두 가지 접근법(PDO 또는 PDX) 중 어느 것도 진행된 임상 환경을 재현할 수 없습니다. 또한, 종양 성장의 특정 부위는 약물 효능 및 질병 예후에 영향을 미치는 중요한 생물학적 특성을 결정하는 것으로 나타났다2. 따라서 임상적으로 유의미한 전이성 환경에서 항암제의 효능을 평가하는 데 사용할 수 있는 전임상 모델 구축이 시급하다6.
마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 스캐너는 축소된 임상 CT 스캐너로 기능할 수 있으며, 암 환자의 CT 영상에 비례하는 확대된 이미지 해상도로 생쥐의 원발성 종양 및 전이 영상을 제공할 수 있다7. μCT 기법의 열악한 연조직 조영제를 상쇄하기 위해 방사선 요오드화 조영제를 사용하여 조영제를 개선하고 종양 부담을 평가할 수 있습니다. 이중 조영제 접근법을 사용하여 구강 및 복강 내 요오드를 서로 다른 타이밍에 투여합니다. 경구로 투여된 조영제는 종양 조직과 장 내 맹장 함량 사이의 한계를 정의하는 데 도움이 됩니다. 다른 한편으로는, 복강내로 투여된 조영제는 종양 덩어리의 외부 한계를 식별할 수 있게 해주는데, 종양 덩어리는 자주 성장하여 복막8을 침범한다.
이 원고는 면역결핍 마우스의 맹장벽에 환자 유래 암세포의 정형외피 이식을 수행하는 프로토콜과 μCT 스캔을 사용하여 장 종양 성장을 모니터링하는 방법론을 설명합니다. 본 논문은 PDO나 PDXO 모델로는 연구할 수 없는 CRC 환자의 진행성 장 종양 및 전이성 질환의 임상 시나리오를 재현한 것이다. CRC의 orthotopic PDX 모델은 CRC 환자의 임상 시나리오를 요약하기 때문에 진행성 장 종양 및 전이성 질환에서 항종양제의 효능을 테스트하는 데 현재까지 가장 적합하다는 결론을 내렸습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지난 수십 년 동안 대장암(CRC)을 포함한 다양한 종양 유형의 환자를 대상으로 많은 새로운 항암 치료법이 개발되고 테스트되었습니다. 많은 사례에서 전임상 모델에서 유망한 결과가 관찰되었지만, 진행성 전이성 CRC 환자에 대한 치료 효능은 종종 제한되었습니다. 따라서 임상적으로 관련된 전이성 시나리오에서 새로운 치료 약물의 효능을 테스트할 수 있는 전임상 모델이 시급합니다.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellex Foundation, CIBERONC 네트워크 및 Instituto de Salud Carlos III의 지원에 감사드립니다. 또한 실험이 수행된 Vall d’Hebron Research Institute(VHIR)의 전임상 이미징 플랫폼에도 감사드립니다.
Materials
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | – | – | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | – | – | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | – | – | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | – | – | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | – | – | |
| Heating pad | – | – | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | – | – | |
| Surfasafe | – | – | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
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