إعادة تشكيل العمارة الخلوية ووظيفة الأنسجة الظهارية البشرية على رقاقة عضو مفتوحة
Summary
يصف هذا البروتوكول القدرات وطرائق الاستزراع الأساسية لرقاقة الجهاز المفتوح من أجل الإنشاء الناجح ونضج مزارع الأعضاء على الرقاقة كاملة السماكة للأنسجة الأولية (الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والأمعاء) ، مما يوفر الفرصة للتحقيق في الجوانب الوظيفية المختلفة للواجهة الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية البشرية في المختبر.
Abstract
تصطف جميع الأعضاء البشرية تقريبا مع الأنسجة الظهارية ، التي تضم طبقة واحدة أو عدة طبقات من الخلايا المتصلة بإحكام منظمة في هياكل ثلاثية الأبعاد (3D). واحدة من الوظائف الرئيسية للظهارة هي تشكيل الحواجز التي تحمي الأنسجة السفلية ضد الإهانات الفيزيائية والكيميائية والعوامل المعدية. بالإضافة إلى ذلك ، تتوسط الظهارة في نقل العناصر الغذائية والهرمونات وجزيئات الإشارات الأخرى ، وغالبا ما تخلق تدرجات كيميائية حيوية توجه وضع الخلايا وتقسيمها داخل العضو. نظرا لدورها المركزي في تحديد بنية الأعضاء ووظيفتها ، تعد الظهارة أهدافا علاجية مهمة للعديد من الأمراض البشرية التي لا يتم التقاطها دائما بواسطة النماذج الحيوانية. إلى جانب الاختلافات الواضحة بين الأنواع ، فإن إجراء دراسات بحثية حول وظيفة الحاجز وخصائص نقل الظهارة في الحيوانات يتفاقم بسبب صعوبة الوصول إلى هذه الأنسجة في نظام حي. في حين أن ثقافات الخلايا البشرية ثنائية الأبعاد (2D) مفيدة للإجابة على الأسئلة العلمية الأساسية ، إلا أنها غالبا ما تسفر عن تنبؤات ضعيفة في الجسم الحي . للتغلب على هذه القيود ، في العقد الماضي ، ظهر عدد كبير من منصات المحاكاة الحيوية المهندسة بدقة ، والمعروفة باسم الأعضاء على رقاقة ، كبديل واعد للاختبارات التقليدية في المختبر والحيوانات. هنا ، نصف رقاقة الجهاز المفتوحة (أو رقاقة مفتوحة العلوي) ، وهي منصة مصممة لنمذجة الأنسجة الظهارية الخاصة بالأعضاء ، بما في ذلك الجلد والرئتين والأمعاء. توفر هذه الشريحة فرصا جديدة لإعادة تشكيل البنية متعددة الخلايا ووظيفة الأنسجة الظهارية ، بما في ذلك القدرة على إعادة إنشاء مكون انسجة 3D من خلال دمج الخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة والخلايا البطانية داخل نظام نشط ميكانيكيا. توفر هذه الشريحة المفتوحة أداة غير مسبوقة لدراسة التفاعلات الظهارية / الوسيطة والأوعية الدموية على مستويات متعددة من الدقة ، من الخلايا المفردة إلى تركيبات الأنسجة متعددة الطبقات ، مما يسمح بالتشريح الجزيئي للحديث المتبادل بين الخلايا للأعضاء الظهارية في الصحة والمرض.
Introduction
تاريخيا ، اعتمد العلماء على الاختبارات قبل السريرية على الحيوانات لاكتشاف الأدوية ، ولكن تم التشكيك في عدد متزايد من هذه الطرق بسبب ضعف الارتباط بالنتيجة البشرية1. إن تنفيذ مبادئ “3Rs” لاستبدال التجارب على الحيوانات وتقليلها وصقلها يحث العلماء على إيجاد طرق بديلة جديدة في المختبر لدعم تقييم مخاطر الأدوية والسموم الكيميائية قبل السريرية2. ومع ذلك ، فإن العديد من النماذج المختبرية التي تم تطويرها حتى الآن تفتقر إلى البنية البيولوجية والتعقيد الخلوي والبيئة الميكانيكية اللازمة لتلخيص الطبيعة الديناميكية للأعضاء الحية البشرية 3,4.
عادة ما تستخدم الأنظمة قبل السريرية التقليدية في المختبر زراعات أحادية 2D للخلايا البشرية المزروعة على سطح بلاستيكي صلب. توفر هذه الأساليب أداة لإجراء دراسات ميكانيكية بسيطة وتمكن من الفحص السريع للأدوية المرشحة. نظرا لتكلفتها المنخفضة نسبيا وقوتها العالية ، غالبا ما يتم إقران نماذج 2D بأنظمة أوتوماتيكية عالية الإنتاجية وتستخدم لتحديد سريع للأدوية المرشحة المحتملة خلال المرحلة المبكرة من عملية تطوير الأدوية 5,6. ومع ذلك ، فإن نماذج 2D هذه لا توفر نهجا متعديا لنمذجة الاستجابات على مستوى الأنسجة أو على مستوى الأعضاء أو النظامية للمرشحين العلاجيين ، وهو أمر ضروري للتنبؤات الدقيقة بسلامة الأدوية وفعاليتها خلال المرحلة قبل السريرية من تطورها. لا تلخص مزارع الخلايا المسطحة البيئة المكروية للأنسجة الأصلية ، بما في ذلك التفاعل المعقد متعدد الخلايا ، والخصائص الميكانيكية الحيوية ، والبنية ثلاثية الأبعاد (3D) للأنسجة البشرية7. غالبا لا تكتسب الخلايا التي تنمو على سطح مستو نمطا ظاهريا ناضجا؛ ومن ثم لا يمكنها الاستجابة للمثيرات الدوائية كما تفعل في الأنسجة الأصلية. على سبيل المثال ، تظهر الخلايا الظهارية السنخية البشرية الأولية التي تنمو في المختبر نمطا ظاهريا حرشفيا وتفقد علامات النمط الظاهري الرئيسية ، بما في ذلك البروتينات الخافضة للتوتر السطحي C و B (SP-C و SP-B)8. بالإضافة إلى التمايز غير الكافي ، غالبا ما تصبح الخلايا الأولية غير حساسة للضغوط البيولوجية في المختبر ، حيث تصبح بعض المسارات الكيميائية الحيوية المرتبطة بالتهاب الأنسجة غير وظيفية9. يبدو أن هذا الفقدان لوظيفة الخلية يرتبط في المقام الأول باستخدام ركائز صلبة بالإضافة إلى نقص العوامل القابلة للذوبان التي تطلقها بشكل طبيعي الخلايا اللحمية الخاصة بالأنسجة مثل الخلايا الليفية الرئوية وخلايا العضلات الملساء10,11.
إن فهم أن الافتقار إلى التعقيد الكيميائي الفيزيائي والبيولوجي يحد من السلوك الفسيولوجي للخلايا في المختبر قد عزز تطوير نماذج متعددة الخلايا أكثر تطورا ، والتي أثبتت أنها تلتقط بشكل أفضل تعقيد الأنسجة البشرية خارج الجسم12,13. منذ إنشاء أول نماذج الثقافة المشتركة في أوائل سبعينيات القرن العشرين14 ، أدى إدخال الهلاميات المائية الاصطناعية والطبيعية إلى تحسين القدرة على تقليد البيئات الدقيقة للأنسجة الأصلية بشكل كبير وأصبح أداة لا تقدر بثمن لدفع التمايز الخلوي ، وتوجيه التنظيم الذاتي للخلايا إلى هياكل تشبه الأنسجة ، واستعادة وظائف الأنسجة الأصلية15,16. على سبيل المثال ، عندما تزرع في سقالة 3D المناسبة ، يمكن للخلايا البشرية أن ترتب ذاتيا في هياكل وظيفية مثل الكرويات أو المواد العضوية ، معبرة عن علامات الخلايا الجذعية ، وتكون قادرة على التجديد الذاتي17. في المقابل ، فإن الخلايا البشرية (بما في ذلك الخلايا الجذعية) ، عندما تنمو على ركائز 2D التقليدية ، تتقدم في العمر بسرعة وتخضع للشيخوخة بعد بضع مقاطع18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن “تخصيص” الهلاميات المائية لتتناسب مع خصائص الأنسجة المحددة مثل المسامية وحجم المسام وسمك الألياف ومرونة اللزوجة والتضاريس والصلابة أو هندستها بشكل أكبر مع المكونات الخلوية المشتقة من الأنسجة و / أو الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تمكن من محاكاة الظروف الفسيولوجية أو المرضية19,20. على الرغم من إمكاناتها الهائلة لاختبار الأدوية ، فإن النماذج القائمة على الهيدروجيل 3D المستخدمة في الأبحاث الصيدلانية لا تلخص بشكل كامل البنية الخلوية المعقدة للأنسجة في الجسم الحي وتفتقر إلى محفزات الدورة الدموية والميكانيكية المهمة الموجودة عادة في جسم الإنسان ، بما في ذلك الضغط الهيدروستاتيكي والتمدد الدوري وقص السوائل21.
ظهرت الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة (MPSs) مثل الأعضاء على الرقائق (OOCs) مؤخرا كأدوات قادرة على التقاط الاستجابات الفسيولوجية المعقدة في المختبر22,23. غالبا ما تستخدم هذه النماذج استخدام منصات الموائع الدقيقة ، والتي تمكن من نمذجة البيئة المكروية الديناميكية للأعضاء الحية.
لقد جمعنا بين مبادئ الهندسة الحيوية للأنسجة 3D وعلم الأحياء الميكانيكي لإنشاء نموذج رقاقة مفتوح للأنسجة الظهارية البشرية المعقدة. سمح لنا ذلك بتلخيص البيئة المكروية متعددة الخلايا والديناميكية للأنسجة الظهارية عن كثب. وهذا يشمل الإشارات البيوكيميائية والميكانيكية الحيوية الخاصة بالأنسجة الموجودة بشكل طبيعي في الأعضاء الحية ولكن غالبا ما يتم إهمالها من قبل النماذج التقليدية في المختبر 24. تشتمل الرقاقة المفتوحة على جزأتين: حجرة وعائية (الشكل 1 أ) وحجرة انسجة (الشكل 1 ب) مفصولة بغشاء مسامي ، مما يسمح بنشر العناصر الغذائية بين الغرفتين (الشكل 1 ج). تتعرض حجرة الأوعية الدموية لتدفق مستمر للسوائل لتلخيص إجهاد القص الفسيولوجي ، بينما يسمح التصميم القابل للتمدد للغرفة اللحمية بنمذجة الإجهاد الميكانيكي المرتبط بحركات التنفس أو التمعج المعوي. تحتوي المقصورة اللحمية على سقالة هيدروجيل 3D القابلة للضبط المصممة لدعم النمو الفسيولوجي للخلايا الليفية الخاصة بالأنسجة. إنه يمتلك غطاء قابلا للإزالة يسهل إنشاء واجهة هوائية سائلة ، وهي حالة تسمح بمحاكاة أكبر لفسيولوجيا الإنسان للأنسجة المخاطية بالإضافة إلى الوصول المباشر إلى الأنسجة لإدارة الأدوية مباشرة على الطبقة الظهارية. يلتقط الشكل التكميلي 1 بعض المكونات الرئيسية لتصميم الرقاقة المفتوحة بما في ذلك الأبعاد والمقصورات البيولوجية (الشكل التكميلي 1A-D) بالإضافة إلى الخطوات الفنية الرئيسية الموضحة في هذا البروتوكول (الشكل التكميلي 1E).
يتم تحقيق نضح الرقاقة المفتوحة باستخدام مضخة تمعجية قابلة للبرمجة (الشكل 1 د). يسمح إعداد المضخة التمعجية بإدخال 12 شريحة مفتوحة في وقت واحد. يمكن لمعظم الحاضنات استيعاب إعدادين مما يتيح ثقافة ما يصل إلى 24 شريحة لكل حاضنة. يتم تحقيق التمدد الميكانيكي باستخدام منظم ضغط فراغ قابل للبرمجة حسب الطلب (الشكل 1E). يتكون من منظم فراغ كهربائي هوائي يتم التحكم فيه إلكترونيا بواسطة محول رقمي إلى تناظري. بمعنى آخر ، يقوم منظم الفراغ الكهربائي الهوائي بإنشاء ملف تعريف فراغ جيبي بسعة وتردد يحددهما المستخدم. يتم إنشاء سلالة دورية تتراوح من 0٪ إلى 15٪ عن طريق تطبيق ضغط سلبي على قناة الفراغ للرقاقة المفتوحة بسعة تتراوح من 0 إلى -90 كيلو باسكال وتردد 0.2 هرتز. إنه نظام مصمم خصيصا يعادل وحدة إجهاد Flexcell المتاحة تجاريا والتي تم اعتمادها ووصفها سابقا في أوراق أخرى25. لتقليد تشوه الأنسجة الميكانيكية المرتبط ، على سبيل المثال ، بحركة التنفس في الرئة أو التمعج في الأمعاء ، يطبق المشغل الهوائي موجات الفراغ / الإجهاد الجيبية التي يمكن تعديل حجمها وسعتها لتتناسب مع المستوى الفسيولوجي للإجهاد والتردد الذي تختبره الخلايا البشرية في أنسجتها الأصلية.
هنا ، نصف طريقة فعالة وقابلة للتكرار لهندسة وزراعة مكافئات الظهارة العضوية على نموذج أولي لمنصة رقاقة Open-Top. يسمح بتوليد نماذج أعضاء معقدة مثل الجلد والحويصلات الهوائية ومجرى الهواء والقولون مع دمج تدفق السوائل الوعائية والتمدد الميكانيكي. سنحدد الجوانب الفنية الرئيسية التي يجب مراعاتها أثناء تنفيذ مبادئ هندسة الأنسجة لتوليد نماذج ظهارية معقدة. سنناقش المزايا والقيود المحتملة للتصميم الحالي.
تم الإبلاغ عن نظرة عامة على الخطوات الرئيسية المستخدمة لتحقيق نضج الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك معلمات التدفق والتمدد ، في: الشكل 2 للجلد ، الشكل 3 للحويصلات الهوائية ، الشكل 4 لمجرى الهواء ، والشكل 5 للأمعاء. وترد في الجداول التكميلية معلومات إضافية عن تكوين الوسائط والكواشف المستخدمة في استزراع نماذج الأعضاء المختلفة (الجدول التكميلي 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد؛ والجدول 1 للجلد). الجدول التكميلي 2 للحويصلات الهوائية؛ الجدول التكميلي 3 لمجرى الهواء ، والجدول التكميلي 4 للأمعاء).
Protocol
Representative Results
Discussion
تمثل رقاقة Open-Top منصة تمكينية للتحقيق في التفاعل الخلوي المعقد الذي يحدث بين البطانة والسدى والظهارة في بيئة دقيقة خاضعة للرقابة ، في الوقت الفعلي. توفر هذه التقنية مزايا حاسمة على الثقافات العضوية والعضوية التقليدية ، مثل دمج الإشارات الفيزيائية والكيميائية الحيوية ذات الصلة بإعادة تكو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي
Materials
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] – Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
