オープントップ臓器チップ上でのヒト上皮組織の細胞構造と機能の再構成
Summary
本プロトコルは、初代組織(皮膚、肺胞、気道、および腸)の全層臓器チップ培養の確立と成熟を成功させるためのOpen-Top Organ-Chipの機能と本質的な培養モダリティを説明し、ヒトの上皮/間葉系および血管ニッチ界面のさまざまな機能的側面をin vitroで調査する機会を提供します。
Abstract
ほぼすべての人間の臓器は上皮組織で裏打ちされており、3次元(3D)構造に編成された緊密に接続された細胞の1つまたは複数の層で構成されています。上皮の主な機能の1つは、下線組織を物理的および化学的傷害および感染性病原体から保護する障壁の形成である。さらに、上皮は栄養素、ホルモン、およびその他のシグナル伝達分子の輸送を媒介し、多くの場合、臓器内の細胞の位置決めと区画化を導く生化学的勾配を作成します。上皮は、臓器の構造と機能を決定する上で中心的な役割を果たすため、動物モデルでは必ずしも捕捉されない多くのヒト疾患の重要な治療標的です。明らかな種間の違いに加えて、動物の上皮のバリア機能と輸送特性に関する調査研究を行うことは、生体系でこれらの組織にアクセスすることの難しさによってさらに悪化します。二次元(2D)ヒト細胞培養は、基本的な科学的質問に答えるのに役立ちますが、 in vivo での予測が不十分であることがよくあります。これらの制限を克服するために、過去10年間で、臓器チップとして知られる多数のマイクロエンジニアリングされた生体模倣プラットフォームが、従来の in vitro および動物実験の有望な代替手段として浮上しました。ここでは、皮膚、肺、腸などの臓器特異的な上皮組織をモデル化するために設計されたプラットフォームであるオープントップ臓器チップ(またはオープントップチップ)について説明します。このチップは、機械的に活性なシステム内に組織特異的な線維芽細胞と内皮細胞を組み込むことによって3D間質成分を再現する機能を含む、上皮組織の多細胞構造と機能を再構成するための新しい機会を提供します。このOpen-Top Chipは、単一細胞から多層組織構築物まで、複数の解像度スケールで上皮/間葉系および血管の相互作用を研究するための前例のないツールを提供し、健康と疾患における上皮化臓器の細胞間クロストークの分子解剖を可能にします。
Introduction
歴史的に、科学者は創薬のために前臨床動物実験に依存してきましたが、人間の転帰との相関性が低いため、これらの方法の多くが疑問視されてきました1。動物実験を置き換え、削減し、改良するための「3R」原則の実施は、科学者に前臨床薬物および化学毒物学のリスク評価をサポートするための新しいin vitro代替方法を見つけることを促します2。しかし、これまでに開発された多くのin vitroモデルは、人間の生体器官の動的な性質を再現するために必要な生物学的構造、細胞の複雑さ、および機械的環境を欠いています3,4。
従来のin vitro前臨床システムでは、通常、硬質プラスチック表面上で増殖したヒト細胞の2D単培養が使用されます。これらの方法は、簡単な機構研究を行うためのツールを提供し、医薬品候補の迅速なスクリーニングを可能にします。2Dモデルは比較的低コストで堅牢性が高いため、自動ハイスループットシステムと組み合わされることが多く、医薬品開発プロセスの初期段階で潜在的な医薬品候補を迅速に特定するために使用されます5,6。しかし、このような2Dモデルは、治療薬候補に対する組織レベル、臓器レベル、または全身反応をモデル化するためのトランスレーショナルアプローチを提供しておらず、開発の前臨床段階での医薬品の安全性と有効性を正確に予測する必要があります。フラットセル培養では、複雑な多細胞相互作用、生体力学的特性、ヒト組織の3次元(3D)構造など、天然の組織の微小環境を再現することはできません7。平坦な表面上で増殖する細胞は、成熟した表現型を獲得しないことが多く、したがって、天然組織の場合のように薬理学的刺激に応答することができません。例えば、in vitroで増殖した初代ヒト肺胞上皮細胞は、扁平上皮表現型を示し、サーファクタントタンパク質CおよびB(SP-CおよびSP-B)8を含む重要な表現型マーカーを失います。不十分な分化に加えて、初代細胞は、組織の炎症に関連する特定の生化学的経路が機能しなくなるため、in vitroで生物学的ストレッサーに対して鈍感になることがよくあります9。このような細胞機能の喪失は、主に硬い基質の使用と、肺線維芽細胞や平滑筋細胞などの組織特異的間質細胞によって自然に放出される可溶性因子の欠如に関連しているようです10,11。
化学的物理的および生物学的複雑さの欠如がin vitroでの細胞の生理学的挙動を制限することを理解することで、より洗練された多細胞モデルの開発が促進され、体外のヒト組織の複雑さをよりよく捉えることが証明されています12,13。1970年代初頭に最初の共培養モデルが作成されて以来14、合成および天然のヒドロゲルの導入により、天然の組織微小環境を模倣する能力が大幅に向上し、細胞分化を促進し、細胞の自己組織化を組織様構造に導き、天然の組織機能を回復するための貴重なツールになりました15,16.例えば、適切な3D足場で増殖させると、ヒト細胞はスフェロイドやオルガノイドなどの機能的な構造に自己配列し、幹細胞マーカーを発現し、自己複製することができます17。対照的に、ヒト細胞(幹細胞を含む)は、従来の2D基質上で増殖すると、急速に老化し、数回継代した後に老化を受ける18。さらに、ヒドロゲルは、多孔性、孔径、繊維の太さ、粘弾性、トポグラフィー、剛性などの特定の組織特性に合わせて「調整」することも、組織由来の細胞成分および/または生理活性分子でさらに操作して、生理学的または病理学的状態のエミュレーションを可能にすることもできます19,20.医薬品研究で使用される3Dヒドロゲルベースのモデルは、薬物試験の大きな可能性を秘めているにもかかわらず、in vivo組織の複雑な細胞構造を完全に再現しておらず、静水圧、周期的伸張、流体せん断など、人体に通常存在する重要な血行動態および機械的刺激を欠いています21。
臓器チップ(OOC)などの微小生理学的システム(MPS)は、インビトロで複雑な生理学的応答をキャプチャできるツールとして最近登場しました22,23。これらのモデルは、多くの場合、生体の動的な微小環境のモデリングを可能にするマイクロ流体プラットフォームの使用を採用しています。
3D組織バイオエンジニアリングとメカノバイオロジーの原理を組み合わせて、複雑なヒト上皮組織のオープントップチップモデルを作成しました。これにより、上皮組織の多細胞で動的な微小環境を詳細に再現することができました。これには、生体器官に自然に存在するが、従来のin vitroモデルでは無視されることが多い組織特異的な生化学的および生体力学的手がかりが含まれます24。Open-Top Chipには、多孔質膜で区切られた血管コンパートメント(図1A)と間質コンパートメント(図1B)の2つのコンパートメントが組み込まれており、2つのチャンバー間で栄養素を拡散させることができます(図1C)。血管コンパートメントは、生理学的せん断応力を再現するために連続的な流体の流れにさらされ、間質チャンバーの伸縮性のある設計により、呼吸運動または腸の蠕動運動に関連する機械的ひずみのモデリングが可能になります。間質コンパートメントには、組織特異的線維芽細胞の生理学的成長をサポートするように設計された調整可能な3Dヒドロゲル足場が収容されています。これは、空気 – 液体界面の確立を容易にする取り外し可能な蓋を有し、粘膜組織のヒト生理機能のより大きなエミュレーションを可能にする条件、ならびに上皮層に直接薬物を投与するための組織への直接アクセスを可能にする。補足図1は、寸法や生物学的コンパートメント(補足図1A-D)を含むオープントップチップ設計の主要コンポーネントのいくつかと、このプロトコルで説明されている主な技術的ステップ(補足図1E)を示しています。
オープントップチップの灌流は、プログラム可能な蠕動ポンプで実現されます(図1D)。ペリスタルティックポンプのセットアップにより、12個のオープントップチップを同時に灌流できます。ほとんどのインキュベーターは、インキュベーターあたり最大24チップの培養を可能にする2つのセットアップを収容できます。機械的延伸は、カスタムメイドのプログラム可能な真空圧力調整器を使用して実現されます(図1E)。これは、デジタル-アナログコンバータによって電子的に制御される電空真空レギュレータで構成されています。言い換えれば、電空真空レギュレータは、ユーザーが決定する振幅と周波数を持つ正弦波真空プロファイルを生成します。0%から15%の範囲の周期ひずみは、0〜-90kPaの範囲の振幅と0.2Hzの周波数でオープントップチップの真空チャネルに負圧を加えることによって生成されます。これは、以前に採用され、他の論文25に記載されている市販のFlexcellひずみユニットと同等のカスタムメイドのシステムです。例えば、肺の呼吸運動や腸の蠕動運動に関連する機械的組織変形を模倣するために、空気圧アクチュエータは正弦波真空/ひずみ波を適用し、その大きさと振幅は、ヒト細胞が本来の組織で経験する歪みと周波数の生理学的レベルに一致するように調整できます。
ここでは、プロトタイプのOpen-Top Chipプラットフォーム上で有機型上皮等価物をエンジニアリングおよび培養するための効率的で再現性のある方法について説明します。これにより、血管液の流れと機械的伸張を統合しながら、皮膚、肺胞、気道、結腸などの複雑な臓器モデルを生成できます。複雑な上皮モデルを生成するための組織工学の原理を実装する際に考慮しなければならない重要な技術的側面を概説します。現在の設計の利点と考えられる制限について説明します。
流れとストレッチのパラメーターを含む、組織と臓器の成熟を達成するために使用される主なステップの概要は、皮膚の場合の図2、肺胞の場合の図3、気道の場合の図4、および腸の場合の 図5で報告されています。 異なる臓器モデルの培養に使用される培地組成および試薬に関する追加情報は、補足表に含まれています(皮膚については補足表1;肺胞の補足表2;気道については附則表3、腸については附則表4)。
Protocol
Representative Results
Discussion
Open-Top Chipは、制御された微小環境において内皮、間質、上皮の間で発生する複雑な細胞相互作用をリアルタイムで調査するためのプラットフォームです。この技術は、流体せん断(流れ)、周期的伸張、マイクロパターニングによって達成される上皮表面トポグラフィの再構築など、ヒト組織の微小環境の再構成に関連する物理的および生化学的手がかりの統合など、従来の有機型およびオル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ
Materials
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] – Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
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