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Immunology and Infection

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.

Abstract

Bestimmte Stimuli, wie z. B. Mikroorganismen, veranlassen Neutrophile, neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freizusetzen, bei denen es sich im Wesentlichen um netzartige Strukturen handelt, die aus DNA mit Körnerproteinen wie Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) sowie zytoplasmatischen und zytoskelettalen Proteinen bestehen. Obwohl das Interesse an NETs in letzter Zeit zugenommen hat, gibt es keine empfindliche, zuverlässige Testmethode für die Messung von NETs im klinischen Umfeld. Dieser Artikel beschreibt einen modifizierten Sandwich-Enzym-gekoppelten Immunosorbent-Assay zur quantitativen Messung von zwei Komponenten zirkulierender NETs, MPO-DNA und NE-DNA-Komplexe, die spezifische Bestandteile von NETs sind und als Abbauprodukte von NETs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Der Assay verwendet spezifische monoklonale Antikörper gegen MPO oder NE als Fängerantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper. MPO oder NE bindet während der ersten Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers. Dieser Assay weist eine gute Linearität und eine hohe Präzision zwischen und innerhalb des Assays auf. Wir setzten es bei 16 Patienten mit COVID-19 und damit einhergehendem akutem Atemnotsyndrom ein und stellten fest, dass die Plasmakonzentrationen von MPO-DNA und NE-DNA signifikant höher waren als im Plasma gesunder Kontrollen. Dieser Detektionsassay ist eine zuverlässige, hochempfindliche und nützliche Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs in humanen Plasma- und Kulturüberständen.

Introduction

In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung der Bildung von extrazellulären Fallen (NET) in biologischen Flüssigkeiten beschrieben, indem der Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet wird, um Komplexe von Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) mit DNA 1,2 nachzuweisen. NETs bestehen aus einem DNA-Rückgrat, das mit antimikrobiellen Proteasen aus neutrophilen Granula dekoriert ist 3,4. Sowohl MPO-DNA- als auch NE-DNA-Komplexe sind wichtige und spezifische Bestandteile von NETs und werden als Abbauprodukte von NETsin den extrazellulären Raum freigesetzt 3,4.

Neben ihrer wichtigen physiologischen Rolle bei der antimikrobiellen Abwehr3 haben NETs auch verschiedene pathologische Wirkungen4,5, einschließlich der Förderung der Thrombogenese6 und der Verschlechterung der Sepsis7. Dementsprechend haben NETs in letzter Zeit an Aufmerksamkeit gewonnen. Nichtsdestotrotz hat sich die In-vivo-Quantifizierung von NETs als schwierig erwiesen, da es keine empfindliche, zuverlässige quantitative Assay-Methode gibt.

Es stehen einige Methoden zur Verfügung, darunter die direkte Messung von NETs mittels Fluoreszenzmikroskopie8,9 und Durchflusszytometrie 10 sowie die indirekte Messung von zirkulierender zellfreier DNA, Nukleosomen und citrulliniertem Histon H3, aber jede Methode hat ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen11. Obwohl die immunfluoreszenzmikroskopische Methode spezifisch für NETs ist und die Lokalisation und den Grad der NET-Bildung deutlich zeigt, sind die Proben auf Biopsiegewebe und sezernierte Materialien beschränkt. Darüber hinaus muss diese Methode von erfahrenen Forschern durchgeführt werden und erfordert eine lange Zeit, bis Ergebnisse vorliegen. Die Messung der zirkulierenden Konzentrationen von NET-bezogenen Komponenten mittels Durchflusszytometrie ist einfach und liefert schnell Ergebnisse. Die Methode ist jedoch nicht spezifisch für NETs12.

Wir13 und andere 1,2 haben einen hochempfindlichen und zuverlässigen Assay entwickelt, um die zirkulierenden NET-Komponenten, MPO-konjugierte oder NE-konjugierte DNA, in menschlichem Plasma mit einer modifizierten ELISA-Technik zu messen, die spezifische Antikörper für MPO oder NE als Fangantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper verwendet. Dieser Assay kann auch ex vivo verwendet werden, um NET-Komponenten in Zellkulturüberständen zu identifizieren, die von aktivierten Neutrophilen als Reaktion auf die Stimulation von Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) freigesetzt werden.

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Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von den institutionellen Prüfungsausschüssen der Medizinischen Universität Aichi genehmigt (2017-H341, 2019-H137). Von jedem Teilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

1. Vorbereitung der Reagenzien

HINWEIS: Für die Durchführung des Sandwich-ELISA-Assays werden die Reagenzien wie unten beschrieben vorbereitet.

  1. Puffer der Beschichtung:
    1. Zur Herstellung eines 0,1 mol/l Carbonat-Bicarbonat-Puffers werden 10,6 g wasserfreies Natriumcarbonat (Molekulargewicht, 106 g/mol) und 8,4 g Natriumbicarbonat (Molekulargewicht, 84 g/mol) abgewogen.
    2. Geben Sie es zu ca. 900 ml destilliertem Wasser in einem Becherglas.
    3. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers auf 9,6 ein, indem Sie die erforderliche Menge verdünnter Salzsäure oder Natriumhydroxid hinzufügen.
    4. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät.
    5. Fügen Sie dann das erforderliche Volumen destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu erreichen.
    6. Lagern Sie diesen 0,1 mol/L Karbonat-Bikarbonat-Puffer im Kühlschrank bei 4 °C.
  2. Blockierender Puffer:
    1. Etwa 250 μl 20%iges Natriumazid und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) werden zu 70 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gegeben, die aus 137 mmol/l NaCl, 8,1 mmol/lNa2HPO 4, 2,68 mmol/l KCl und 1,47 mol/l KH2PO 4 (pH7,4) besteht, und vorsichtig mischen.
    2. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erreichen. Die Endkonzentrationen von Rinderserumalbumin und Natriumazid betragen 1 % bzw. 0,05 %. Warten Sie 10 Minuten, dann ist die Lösung gebrauchsfertig.
  3. Waschlösung: 0,5 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol-tert-Octylphenylether (Triton X-100) in destilliertem Wasser herstellen.
    1. Verdünnen Sie 100% Triton X-100 auf 10% mit destilliertem Wasser und lassen Sie die 10%ige Lösung vor Gebrauch 1 Tag stehen.
    2. Anschließend wird die 10%ige Triton X-100-Lösung 20-fach mit destilliertem Wasser erneut verdünnt, um eine Konzentration von 0,5 % zu erreichen.
  4. Verdünnung der Antikörper:
    1. Verdünnen Sie den Fängerantikörper (Anti-MPO-Antikörper [1 mg/ml] oder Anti-NE-Antikörper [1 mg/ml]) vor der Verwendung an Tag 1 des Assays (siehe unten) im Beschichtungspuffer (pH 9,6) auf 1:2.000 und den Nachweisantikörper (Peroxidase-konjugierter Anti-DNA-Antikörper) auf 1:40 mit PBS, bevor Sie ihn an Tag 3 des Assays verwenden (siehe unten).
      HINWEIS: Für das Vorexperiment werden die Isotyp-Antikörper (IgG-Kaninchen [5 mg/ml] und IgG1-Mausklon Ci4 [0,5 mg/ml]) im Beschichtungspuffer (pH 9,6) auf 1:10.000 und 1:1.000 verdünnt.
  5. ABTS-Substratlösung: Je nach Anzahl der Proben eine, zwei oder drei 2,2'-Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)-Tabletten in 5 ml, 10 ml oder 15 ml ABTS-Puffer (mit Natriumperborat, Zitronensäure und Dinatriumhydrogenphosphat) auflösen; pro Probe werden 100 μl benötigt. Lagern Sie die zubereitete Lösung bei 2-8 °C lichtgeschützt. Die Lösung ist bis zu 3 Monate haltbar.

2. Probenentnahme und -lagerung

  1. Plasma-Isolierung:
    1. 4 ml periphere Blutproben werden durch Venenpunktion mit einer 22-g-Spritze in ein Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen entnommen und bei 1.600 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
    2. Den Überstand in ein 2-ml-Probenröhrchen mit sicherem Verschluss überführen.
    3. Der Überstand wird bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C erneut zentrifugiert, um alle Restzellen zu entfernen.
    4. Sammeln Sie den Überstand in einem neuen Probenröhrchen mit sicherer Verriegelung, ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören.
    5. Lagern Sie das erhaltene Plasma bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C.
      HINWEIS: Um mit diesem Assay Ergebnisse mit hohem Durchsatz zu erzielen, sind Proben von guter Qualität erforderlich. Wenn Plasmaproben verwendet werden, führen Sie eine zweite Zentrifugation durch, um alle Restzellen zu entfernen. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen der Proben. Verwenden Sie Heparin als Antikoagulans, da EDTA die DNase-Aktivität beeinflusst.
  2. Isolierung polymorphkerniger Neutrophiler
    1. Die peripheren Blutproben werden durch Venenpunktion mit einer 22-G-Spritze in ein Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen gesammelt.
    2. 6 ml Blut werden auf 6 ml einstufige Polymorphe aufgetragen und die Röhrchen bei 1.000 x g für 45 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.
    3. Entnehmen Sie die dritte Buffy-Coat-Schicht, die Neutrophile enthält, und waschen Sie sie dreimal in phenolrotfreiem RPMI-1640 bei 400 x g für 10 Minuten bei RT.
    4. Resuspendieren Sie die neutrophilen Granulozyten in phenolrotfreiem RPMI-1640, das 2 mM L-Glutamin enthält, ergänzt mit 6% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, und zählen Sie die Zellen im Mikroskopfeld mit einem Hämozytometer.
      HINWEIS: Diese Methode ergibt eine Reinheit von 96 % bis 98 % bei einer Lebensfähigkeit von mehr als 95 %, wie durch den Ausschluss des Farbstoffs Trypanblau bewertet.
  3. Aktivierung von polymorphkernigen Neutrophilen und NETose in vitro
    1. Frisch isolierte polymorphkernige Neutrophile werden auf 1 × 105 Zellen/ml in phenolrotfreiem RPMI-1640 verdünnt, das 2 mM L-Glutamin enthält, ergänzt mit 6 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, und in 35-mm-Kulturschalen ausgesät.
    2. Um NETs zu induzieren, werden polymorphkernige Neutrophile mit 25 nM PMA für 4 h bei 37 °C in 5 % CO2/95 % Luft stimuliert.
    3. Nach 4 h Inkubation werden die NETs teilweise verdaut, indem 0,6 μg/ml DNase I 15 min lang bei RT direkt in die Kulturschalen gegeben werden, und die DNase I-Aktivität durch Zugabe von 5 mM EDTA gestoppt.
    4. Das Medium, das die synthetisierten NETs enthält, wird aufgefangen und bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen.
    5. Die Überstände aus vier gesunden Kontrollen gewinnen, mischen und bis zur Verwendung bei −80 °C lagern.
      HINWEIS: DNase-verdaute PMA-stimulierte Neutrophile, die von vier gesunden Kontrollen gewonnen wurden, werden als NET-Standard 1,14,15 verwendet. Generieren Sie eine Kalibrierkurve aus einem seriell verdünnten NET-Standard mit PBS und weisen Sie die aus einem unverdünnten NET-Standard erhaltenen optischen Dichtewerte (OD) als 100% NET zu.

3. Analysemethode

HINWEIS: Die Schritte zur Durchführung des Assays werden im Folgenden ausführlich beschrieben.

  1. Tag 1
    1. Tragen Sie insgesamt 100 μl verdünnten Anti-MPO- oder Anti-NE-Antikörper mit 0,05 μg Antikörper auf jede Vertiefung der Platte, einschließlich der Blindvertiefung, auf.
      HINWEIS: Der Beschichtungspuffer darf kein Detergens enthalten, da sich die Antikörper sonst nicht gleichmäßig und gleichmäßig an die Wände der einzelnen Vertiefungen binden können. Um den Hakeneffekt zu verhindern, darf die Konzentration des Beschichtungsproteins nicht mehr als 20 μg/ml betragen, da Konzentrationen über diesem Wert die meisten verfügbaren Stellen auf der Mikrotiterplatte sättigen. Der typische Konzentrationsbereich von Proteinbeschichtungslösungen liegt bei 2-10 μg/ml. Für das vorläufige Experiment wird verdünnter Isotyp-Kontrollantikörper IgG-Kaninchen anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen MPO verwendet. Verwenden Sie verdünnte Isotyp-Kontrollantikörper IgG1-Maus für die Beschichtung anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen NE.
    2. Decken Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab, um die Verdunstung der Probe zu verhindern, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C, um die Bindung der Fängerantikörper zu ermöglichen.
  2. Tag 2
    1. Verwerfen Sie die verdünnte Antikörperlösung aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    2. Entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken klopfen.
    3. Blockieren Sie jede Vertiefung der ELISA-Platte mit 200 μl des Blockierungspuffers.
    4. Decken Sie die Platte eng mit einer selbstklebenden Plastikabdeckung ab und inkubieren Sie sie 1,5-2 Stunden lang bei RT, um die Vertiefungen zu verstopfen.
    5. Entsorgen Sie die Blockierungslösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    6. Entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken klopfen.
    7. Tragen Sie insgesamt 25 μl Plasma oder Medium auf jede Vertiefung mit Ausnahme der Leervertiefung auf und fügen Sie 75 μl PBS als Verdünnungsmittel hinzu, um das endgültige Volumen auf 100 μl zu erhöhen. 100 μl PBS in die Leervertiefung geben.
    8. Mischen Sie dann die Proben 10 s lang bei RT, indem Sie die Platte mit 250 U/min auf einen Shaker stellen.
    9. Tragen Sie 2 μl 100-fach verdünnte DNase I (0,03 mg/ml) auf jede Vertiefung auf, einschließlich der Leervertiefung (Endkonzentration von DNase I in der Reaktionsmischung: 0,6 μg/ml).
    10. Versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und mischen Sie die Proben 10 s lang gründlich bei RT, indem Sie die Platte mit 250 U/min auf einen Schüttler legen.
      HINWEIS: Um die optimalen Bedingungen für die DNA-Verdauung zu bewerten, haben wir bei der Entwicklung des Assays Proben, die MPO-assoziierte DNA von Patienten mit COVID-19 enthalten, 15 Minuten lang bei RT mit 0-0,9 μg/ml DNase I inkubiert und Platten verwendet, die mit einem spezifischen Fängerantikörper für MPO oder einem speziesangepassten Isotyp-Kontrollantikörper beschichtet waren.
    11. Inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten bei RT.
    12. Entfernen Sie die selbstklebende Kunststoffabdeckung und tragen Sie 1 μl 0,5 M EDTA auf jede Vertiefung auf, um die DNase-Reaktion zu stoppen.
    13. Verschließen Sie die Platte wieder mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und schütteln Sie sie 15 s lang bei RT, indem Sie sie mit 250 U/min auf einen Shaker legen.
    14. Anschließend wird die Platte über Nacht bei 4 °C inkubiert, damit sich die Proteinkomponenten der NETs an die Fängerantikörper anlagern können.
  3. Tag 3
    1. Entferne die selbstklebende Plastikabdeckung und entsorge die Lösung aus den Vertiefungen.
    2. Verwerfen Sie die Lösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl der Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    3. Tragen Sie insgesamt 100 μl des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-DNA-Nachweisantikörpers auf jede Vertiefung auf.
    4. Verschließen Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang bei RT.
    5. Verwerfen Sie die Lösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.
    6. Entfernen Sie vorsichtig die Restlösung.
    7. Tragen Sie insgesamt 100 μl ABTS-Substratlösung auf jede Vertiefung auf und decken Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab.
    8. Die Platte im Dunkeln bei RT 20-30 min auf einem Shaker bei 250 U/min inkubieren.
      HINWEIS: Überwachen Sie die Platte in 5-Minuten-Intervallen, bis die gewünschten OD-Messwerte erreicht sind.
    9. Fügen Sie insgesamt 50 μl 2 M Schwefelsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
    10. Mischen Sie den flüssigen Inhalt der Vertiefungen, indem Sie vorsichtig auf die Seite der Platte klopfen.
    11. Schalten Sie das Mikroplatten-Lesegerät ein und schließen Sie es an den Computer an.
    12. Öffnen Sie die Softwareanwendung auf dem Computer.
    13. Erstellen Sie in der Statusleiste ein neues Experiment, und geben Sie ihm einen Namen.
    14. Stellen Sie alle folgenden Parameter für das Lesen der Platte ein: Lesetyp, Absorption; Lesemodus, Endpunkt; Wellenlängen, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisches Mischen und Ausblenden vor, Aus; Vorgelesene Platte, Aus; Automatische Kalibrierung, Ein; Streifen, ganze Platte lesen; Wellenlängenpriorität der Spalte, Priorität der Spalte; Wagengeschwindigkeit, Normal; und Automatisches Lesen, Aus.
    15. Legen Sie dann die 96-Well-Platte mit den Proben in die Schublade und schließen Sie sie.
    16. Wählen Sie abschließend die Schaltfläche Lesen , damit die Platte sofort gelesen wird.
    17. Lesen Sie die Absorption jedes Wells bei einer Wellenlänge von 405 nm mit einem Mikroplatten-Reader ab (verwenden Sie in diesem Stadium eine Wellenlänge von 490 nm als Referenz).
    18. Führen Sie eine automatische Subtraktion des Absorptionswerts des Assay-Mediums allein von allen unbekannten Proben durch und speichern Sie die Daten.
      ANMERKUNG: Zur Berechnung der relativen Nettokonzentration in der Probe 1,14,15 ist eine Standardkurve zu verwenden, die aus dem seriell verdünnten NET-Standard gewonnen wurde. Hier werden die Endergebnisse als "MPO- oder NE-DNA-Komplexe (% des NET-Standards)" dargestellt. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde aus der Standardabweichung (SD) und der Steigung der Kalibrierkurve (S) wie folgt berechnet: LOD = 3,3(SD/S).

4. Statistik

  1. Führen Sie alle statistischen Analysen mit einer geeigneten statistischen Analysesoftware durch. Hier kam SigmaPlot v14.5 zum Einsatz. Prozentsätze und kontinuierliche Variablen werden aufgrund der verzerrten Verteilung der meisten Parameter als Median mit dem Interquartilsabstand angezeigt.
  2. Vergleichen Sie die MPO-DNA- und NE-DNA-Plasmaspiegel zwischen COVID-19-Patienten und gesunden Kontrollpersonen mit dem Wilcoxon-Rangsummentest. Verwenden Sie die Korrelationsanalyse, um die Beziehung zwischen der optischen Dichte und dem Prozentsatz des NET-Standards zu untersuchen.

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Representative Results

Bei dieser Methode wurde ein Sandwich-ELISA mit monoklonalen Anti-MPO-, Anti-NE- und Anti-DNA-Antikörpern verwendet, um MPO-assoziierte und NE-assoziierte DNA zu messen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einem MPO- oder NE-spezifischen monoklonalen Antikörper beschichtet, um DNA-assoziiertes MPO und DNA-assoziiertes NE sowie nicht-DNA-assoziiertes MPO und NE einzufangen. Zur Berechnung des Intra-Assay-Variabilitätskoeffizienten (CV) wurden für 30 Proben von Patienten mit COVID-19 und gesunden Kontrollpersonen doppelte Messungen innerhalb derselben Platte durchgeführt, und der %CV wurde als Mittelwert der Doppelmessungen berechnet; Zur Berechnung des Inter-Assay-CV (d. h. der Konsistenz von Platte zu Platte) wurden zwei Arten von Proben von Patienten mit COVID-19 und gesunden Kontrollpersonen im Vierfachverfahren auf 10 verschiedenen Platten gemessen; Um die Spezifität dieses Assays nachzuweisen, wurden verschiedene Konzentrationen von MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexen unter Verwendung von Platten bestimmt, die mit Isotyp-Kontrollantikörpern anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen MPO und NE beschichtet waren. Um die Sensitivität und Linearität des Assays zu berechnen, wurde ein seriell verdünnter NET-Standard untersucht, der durch Stimulation isolierter humaner Neutrophiler mit PMA und mildem DNase-Verdau hergestellt wurde, und der Korrelationskoeffizient und die Nachweisgrenze (LOD) wurden berechnet.

Die Kalibrierungskurven für MPO-DNA und NE-DNA, die aus einem seriell verdünnten NET-Standard gezogen wurden, sind in Abbildung 2 dargestellt. Zuverlässige Standardkurven für MPO-DNA und NE-DNA (R2 = 0,958 bzw. 0,963) werden erhalten, wenn die Absorptionswerte Konzentrationen von 0,93 bzw. 0,90 nicht überschreiten. Die aus der SD und der Steigung der Kalibrierungskurve berechneten LOD-Werte betrugen 0,132 % bzw. 0,126 % für MPO-DNA und NE-DNA (%NET-Standard).

Die höchste OD wurde bei Anwendung von 0,6 μg/ml DNase I erzielt (Abbildung 3). Daher wurde der DNA-Aufschluss auf die Zugabe eines 0,6 μg/ml-Reaktionsgemisches von DNase I für 15 min bei Raumtemperatur beschränkt. Wenn die Platten mit dem iso-Typ-Kontrollantikörper anstelle des spezifischen monoklonalen Antikörpers gegen MPO beschichtet wurden, wurden sehr niedrige OD-Werte (<0,09 Absorptionseinheiten [AU]) bei verschiedenen Konzentrationen von DNase I nachgewiesen.

Zur Berechnung des Intra-Assay-Variabilitätskoeffizienten (CV) für MPO-DNA und NE-DNA wurden Doppelmessungen in 30 Proben von Patienten mit COVID-19 und gesunden Kontrollpersonen in derselben Platte durchgeführt; Der %CV wurde unter Verwendung des doppelten Mittelwerts berechnet. Die Intra-Assay-CVs für MPO-DNA und NE-DNA betrugen 1,871 bzw. 0,987 bei gesunden Kontrollpersonen und 2,532 bzw. 2,010 bei COVID-19-Patienten (Tabelle 1). Die mittleren Intra-Assay-CVs von MPO-DNA und NE-DNA betrugen 2,202 ± 0,467 bzw. 1,497 ± 0,723 (Mittelwert ± SD) (Tabelle 1).

Um die Inter-Assay-CV für MPO-DNA und NE-DNA zu berechnen, wurden zwei Arten von Proben, die von Patienten mit COVID-19 und gesunden Kontrollpersonen gesammelt wurden, im Vierfach auf 10 verschiedenen Platten gemessen, um die Konsistenz von Platte zu Platte zu überwachen. Die mittleren Inter-Assay-CVs von MPO-DNA und NE-DNA betrugen 6,524 ± 2,672 bzw. 4,389 ± 0,923 (Mittelwert ± SD) (Tabelle 2).

Um die Spezifität der Fängerantikörper gegen MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexe zu evaluieren, haben wir verschiedene Konzentrationen von MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexen untersucht, indem wir Platten verwendet haben, die mit Isotyp-Kontrollantikörpern anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen MPO und NE beschichtet waren. Tabelle 3 zeigt, dass die Isotyp-Kontrollantikörper bei den verschiedenen Konzentrationen (0,035 AE bis 0,078 AE und −0,007 AU bis 0,096 AE, bzw. ).

Die Gehalte an MPO-DNA und NE-DNA im Überstand von DNase-verdauten PMA-stimulierten Neutrophilen wurden als 100% NET-Standard definiert, und die Plasmaprobendaten wurden als %NET-Standard ausgedrückt. Die MPO-DNA-Spiegel (%NET-Standard) waren im Plasma von Patienten mit COVID-19 signifikant höher (n = 16; 29,1 % [IQR, 25,8, 41,5]) als im Plasma gesunder Kontrollpersonen (n = 10; 13,4 % [IQR, 12,4, 14,8]), ebenso wie die Spiegel von NE-DNA (%NET-Standard) (46,4 % [IQR, 32,7, 53,7] vs. 12,1 % [IQR, 9,9, 14,7], bzw. P < 0,01; Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1: Grundlegende Schritte einer Sandwich-Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay-Methode zur Messung von Myeloperoxidase-DNA oder neutrophiler Elastase-DNA in Proben. (A) Die Wells sind mit einem Anti-Myeloperoxidase (MPO) oder Anti-Neutrophilen-Elastase (NE)-Fängerantikörper beschichtet. (B) Die verbleibenden Proteinbindungsstellen werden durch Blockierungsmittel blockiert. (C) Proben, die NE-konjugierte und MPO-konjugierte DNA enthalten, werden zugegeben. (D) Es wird ein begrenzter DNase-Aufschluss durchgeführt, und die Probe wird in den Vertiefungen inkubiert, um an den Fängerantikörper zu binden. (E) Ein sekundärer Peroxidase-markierter Anti-DNA-Antikörper wird hinzugefügt. (F) Der ungebundene sekundäre Peroxidase-markierte Anti-DNA-Antikörper wird entfernt. (G) Das Substrat 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) wird zugegeben, und die Farbentwicklung wird überwacht. Abkürzungen: ABTS = 2,2'-Azino-Bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure); MPO = Myeloperoxidase; NE = Neutrophile Elastase Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Linearität der Beziehungen zwischen den Intensitätswerten und den verschiedenen Verdünnungen des neutrophilen extrazellulären Fallenstandards. Der Überstand von DNase-verdauten Phorbol-12-Myristat-13-Acetat-stimulierten Neutrophilen wurde seriell verdünnt, und die Gehalte an Myeloperoxidase-DNA und Neutrophilen-Elastase-DNA wurden untersucht, um eine Kalibrierungskurve zu erzeugen. Die Absorptionseinheiten (AU), die aus dem unverdünnten neutrophilen extrazellulären Fallenstandard (NET-Standard) erhalten wurden, wurden als 100%NET zugeordnet, und die Aufzeichnung des Intensitätswertes bei 405 nm gegen den %NET-Standard ergab einen linearen Zusammenhang. Abkürzungen: MPO = Myeloperoxidase; NE = neutrophile Elastase; NET = Neutrophile extrazelluläre Falle Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Dosis-Wirkungs-Verhältnis von DNase I bei der extrazellulären Trap-DNA-Verdauung von Neutrophilen. Die Probe wurde in Myeloperoxidase-beschichtete Vertiefungen eingeführt. Dann wurde DNase I (0 μg/ml, 0,3 μg/ml, 0,6 μg/ml oder 0,9 μg/ml) zugegeben. Nach 15 Minuten Verdauung wurde die Enzymaktivität gestoppt, und die restlichen Schritte des Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assays wurden entsprechend durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. N = 12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Plasmaspiegel von Myeloperoxidase-DNA und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen bei Patienten mit COVID-19. Die Daten werden als Prozentsätze des Gehalts an neutrophilen extrazellulären Trap-Standards (NET-Standard) ausgedrückt und als Mediane und Interquartilsabstände dargestellt. Patienten mit COVID-19, n = 16; gesunde Kontrollen, n = 10. ** P < 0,01 im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Abkürzungen: HC = gesunde Kontrollen; NET = neutrophile extrazelluläre Falle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Intra-Assay-Variabilitätskoeffizient. Dreißig Proben wurden in doppelter Ausführung gemessen, um die individuellen Variabilitätskoeffizienten zu überwachen und somit den Intra-Assay-Variabilitätskoeffizienten zu bestimmen. Abkürzungen: AU = Absorptionseinheiten; CV = Variabilitätskoeffizienten Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Variabilitätskoeffizient zwischen den Assays. Die Proben wurden vierfach auf 10 verschiedenen Platten gemessen, um die Variation von Platte zu Platte zu überwachen und somit den Variabilitätskoeffizienten zwischen den Assays zu bestimmen. Abkürzungen: AU = Absorptionseinheiten; CV = Variabilitätskoeffizient. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Spezifitätstest für Fängerantikörper. Die Platten wurden mit Isotyp-Kontrollantikörpern für Anti-Myeloperoxidase (MPO) und Anti-Neutrophilen-Elastase (NE) beschichtet, um die Spezifität der Fängerantikörper für die MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexe zu bewerten. Abkürzungen: AU = Absorptionseinheiten; MPO = Myeloperoxidase; NE = neutrophile Elastase Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Discussion

Wir haben eine Sandwich-ELISA-Methode beschrieben, bei der MPO oder NE während der anfänglichen Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers bindet. Nach dem Waschen wird das "Sandwich" vervollständigt, indem die Proben mit einem Peroxidase-assoziierten monoklonalen Anti-DNA-Antikörper inkubiert werden. Nach der Entfernung des ungebundenen Sekundärantikörpers wird das gebundene Peroxidase-Konjugat durch Zugabe eines chromogenen ABTS-Peroxidase-Substrats detektiert, das ein lösliches Endprodukt ergibt, das spektrophotometrisch bei 405 nm abgelesen werden kann. Die gute Linearität und die hohe Präzision zwischen und innerhalb von Assays deuten darauf hin, dass der in dieser und anderen Arbeit beschriebene ELISA-Assay 1,2 zuverlässig und für die klinische Anwendung durchführbar ist. Wenn der Überstand von DNase-behandelten PMA-stimulierten Neutrophilen als Maximalsignal für den NET-Standard zugewiesen wird, kann dieser ELISA-Assay als semiquantitative Methode verwendet werden 1,14,15.

Die langen Chromatinfäden von NETs sind mit MPO- und NE-Proteinen dekoriert. Um die Bindung zwischen dem Fängerantikörper und den MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexen zu erhöhen, werden die Fäden durch begrenzten DNA-Verdau mit dem Enzym DNase in kürzere Stücke geschnitten; die Zugabe einer zu hohen DNase-Konzentration könnte zu einer übermäßigen Verdauung der DNA und damit zu einer Abnahme der Absorption führen. Die Ergebnisse eines vorläufigen Experiments (siehe Abbildung 3) zeigten, dass eine angemessene Menge an DNase-Zugabe notwendig ist, um die von NETs abgeleiteten Reste zu lösen. Die Experimente, in denen Kontrollantikörper vom Isotyp anstelle von spezifischen Fängerantikörpern verwendet wurden, zeigten, dass die in diesem Assay verwendeten Fängerantikörper spezifisch für MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexe waren.

Das frühe Stadium der NET-Bildung ist gekennzeichnet durch dekondensiertes Chromatin und die Erhaltung der Intensität der Plasmamembran 9,16,17. Neutrophile mit einem kondensierten Zellkern wurden als Neutrophile identifiziert, die sich in der NET-Bildung befinden und durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden können10. Obwohl die Durchflusszytometrie eine große Anzahl von Bildern von Zellen in kurzer Zeit analysieren kann, kann sie nicht verwendet werden, um die späteren Stadien der NET-Bildung nach dem Bruch der Zellmembran und der Extrusion von Chromatin zu bewerten. Citrullinierte Histone H3, von denen bekannt ist, dass sie NET-spezifische Marker sind, können durch Western Blot18 und ELISA19 nachgewiesen werden; Diese Methoden sind jedoch nur spezifisch für die PAD4-bezogene NET-Bildung und können nicht zur Bewertung von PAD4-unabhängigen NETsverwendet werden 20.

Der Befund, dass die Spiegel der Serum-NET-Reste bei Patienten mit COVID-19 höher waren als bei gesunden Kontrollpersonen, stimmt mit früheren Berichtenüberein 21,22. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Aktivierung von Neutrophilen, einschließlich der NET-Bildung, eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von COVID-19 spielen könnte.

Dieser Assay hat eine Einschränkung. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass immunbezogene Gene, einschließlich MPO und ELANE, die MPO bzw. NE kodieren, unter unkontrollierten entzündlichen Bedingungen stark exprimiert werden23 und positiv mit der Schwere der Erkrankung und der Mortalität korrelieren24. Da MPO und NE unabhängig von diesen enzymatischen Aktivitäten an der Bildung von NETs beteiligt sind15, können erhöhte Proteinspiegel von NE und MPO in neutrophilen Granulozyten die Ergebnisse dieses Assays beeinflussen.

Wir schlussfolgern, dass diese Sandwich-ELISA-Methode extrazelluläre DNA mit Körnerproteinen, einschließlich NE und MPO, die spezifisch für die NET-Bildung sind, direkt misst. Dieser Nachweisassay ist eine zuverlässige, hochempfindliche und nützliche Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs in menschlichen Proben und Kulturüberständen.

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Disclosures

Alle Daten, die während dieser Studie generiert und/oder analysiert wurden, sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Huq Muhammad Aminul für die Unterstützung bei der Begutachtung des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

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References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

Immunologie und Infektion Heft 195
Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA
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Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

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