Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Представлен протокол модифицированного метода иммуноферментного анализа для количественного измерения двух компонентов остатков внеклеточной ловушки нейтрофилов: конъюгированной ДНК миелопероксидазы и конъюгированных ДНК нейтрофильной эластазы, полученных из активированных нейтрофилов.

Abstract

Некоторые раздражители, такие как микроорганизмы, заставляют нейтрофилы высвобождать нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), которые в основном представляют собой паутиноподобные структуры, состоящие из ДНК с гранулярными белками, такими как миелопероксидаза (МПО) и нейтрофильная эластаза (НЭ), а также цитоплазматические и цитоскелетные белки. Несмотря на то, что интерес к НВЛ в последнее время возрос, не существует чувствительного и надежного метода анализа для измерения НВЛ в клинических условиях. В данной статье описан модифицированный сэндвич-фермент-связанный иммуносорбентный анализ для количественного измерения двух компонентов циркулирующих НВЛ, комплексов МПО-ДНК и НЭ-ДНК, которые являются специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ. В анализе используются специфические моноклональные антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. МПО или НЭ связывается с одним участком захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. Этот анализ показывает хорошую линейность и высокую межпробирную и внутрипробную точность. Мы использовали его у 16 пациентов с COVID-19 с сопутствующим острым респираторным дистресс-синдромом и обнаружили, что плазменные концентрации МПО-ДНК и НЭ-ДНК были достоверно выше, чем в плазме, полученной от здоровых контрольных групп. Этот детектирующий анализ является надежным, высокочувствительным и полезным методом для исследования характеристик НВЛ в плазме крови и надосадочной жидкости культуры.

Introduction

В статье описан метод количественной оценки образования внеклеточной ловушки нейтрофилов (НВЛ) в биологических жидкостях с помощью сэндвич-ферментного иммуносорбентного анализа (ИФА) для выявления комплексов миелопероксидазы (МПО) и нейтрофильной эластазы (НЭ) с ДНК 1,2. НВЛ состоят из ДНК-каркаса, украшенного антимикробными протеазами, происходящими из гранул нейтрофилов 3,4. Комплексы МПО-ДНК и НЭ-ДНК являются важными и специфическими компонентами НВЛ и высвобождаются во внеклеточное пространство в виде продуктов распада НВЛ 3,4.

Помимо своей важной физиологической роли в противомикробной защите3, НВЛ также оказывают различные патологические эффекты4,5, включая стимулирование тромбогенеза6 и ухудшение сепсиса7. Соответственно, в последнее время НЭО привлекают к себе внимание. Тем не менее, количественная оценка НВЛ in vivo оказалась сложной задачей из-за отсутствия чувствительного и надежного метода количественного анализа.

Существует несколько методов, в том числе прямое измерение НВЛ с помощью флуоресцентной микроскопии8,9 и проточной цитометрии 10, а также косвенное измерение циркулирующей внеклеточной ДНК, нуклеосом и цитруллинированного гистонов H3, но каждый метод имеет свои преимущества и ограничения11. Несмотря на то, что иммунофлуоресцентный микроскопический метод специфичен для НВЛ и четко показывает локализацию и степень образования НВЛ, образцы ограничиваются биопсийной тканью и секретируемыми материалами. Более того, этот метод должен выполняться квалифицированными исследователями и требует длительного времени для получения результатов. Измерение циркулирующих уровней компонентов, связанных с НВЛ, с помощью проточной цитометрии является простым и быстрым получением результатов; однако этот метод не является специфичным для NETs12.

Мы13 и другие1,2 разработали высокочувствительный и надежный анализ для измерения циркулирующих компонентов НВЛ, МПО-конъюгированной или NE-конъюгированной ДНК, в плазме крови человека с помощью модифицированной методики ИФА, которая использует специфические антитела к МПО или НЭ в качестве захватных антител и ДНК-специфические детектирующие антитела. Этот анализ также может быть использован ex vivo для идентификации компонентов НВЛ в супернатантах клеточных культур, высвобождаемых активированными нейтрофилами в ответ на стимуляцию форболом-12-миристат-13-ацетатом (ПМА).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Данное исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено институциональными наблюдательными советами Медицинского университета Айти (2017-H341, 2019-H137). От каждого участника было получено письменное информированное согласие.

1. Приготовление реагента

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения сэндвич-ИФА реагенты готовятся, как описано ниже.

  1. Буфер покрытия:
    1. Чтобы сделать карбонатно-бикарбонатный буфер 0,1 моль/л, взвесьте 10,6 г безводного карбоната натрия (молекулярная масса 106 г/моль) и 8,4 г бикарбоната натрия (молекулярная масса 84 г/моль).
    2. Добавьте его примерно в 900 мл дистиллированной воды в стакане.
    3. Отрегулируйте рН буфера до 9,6, добавив необходимое количество разбавленной соляной кислоты или гидроксида натрия.
    4. Проверьте рН с помощью рН-метра.
    5. Затем добавьте необходимый объем дистиллированной воды, чтобы получить общий объем 1 000 мл.
    6. Храните карбонатно-бикарбонатный буфер 0,1 моль/л в холодильнике при температуре 4 °C.
  2. Блокирующий буфер:
    1. Добавьте примерно 250 мкл 20% азида натрия и 1 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) к 70 мл фосфатно-солевого буфера (ФБС), состоящего из 137 ммоль/л NaCl, 8,1 ммоль/лNa2HPO 4, 2,68 ммоль/л KCl и 1,47 моль/л KH2PO 4 (pH7,4), и осторожно перемешайте.
    2. Добавьте дистиллированную воду до достижения общего объема 100 мл. Конечные концентрации бычьего сывороточного альбумина и азида натрия составляют 1% и 0,05% соответственно. Подождите 10 минут, после чего раствор готов к использованию.
  3. Промывочный раствор: Приготовить 0,5% t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол, трет-октилфениловый эфир полиэтиленгликоля (Тритон Х-100) в дистиллированной воде.
    1. Разбавьте 100% Triton X-100 до 10% дистиллированной водой и дайте 10% раствору постоять 1 день перед использованием.
    2. Затем повторно разбавьте 10% раствор Triton X-100 в 20 раз дистиллированной водой до достижения концентрации 0,5%.
  4. Разведение антител:
    1. Разбавьте захватное антитело (антитело к MPO [1 мг/мл] или антитело к NE [1 мг/мл]) до 1:2 000 в буфере покрытия (pH 9,6) перед использованием в 1-й день анализа (см. ниже) и антитело к обнаружению (пероксидаза-конъюгированное анти-ДНК-антитело) до 1:40 с PBS перед использованием на 3-й день анализа (см. ниже).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для предварительного эксперимента разбавьте антитела изотипа (IgG кролика [5 мг/мл] и мышиного клона IgG1 Ci4 [0,5 мг/мл]) до 1:10 000 и 1:1 000 в буфере покрытия (pH 9,6).
  5. Раствор субстрата ABTS: В зависимости от количества образцов растворите одну, две или три таблетки 2,2'-азино-биса (3 таблетки этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты (АБТС) в 5 мл, 10 мл или 15 мл буфера ABTS (содержащего перборат натрия, лимонную кислоту и динатрийный гидрофосфат); на образец необходимо 100 мкл. Приготовленный раствор хранить при температуре 2-8 °С в защищенном от света месте. Раствор стабилен до 3 месяцев.

2. Отбор и хранение проб

  1. Плазменная изоляция:
    1. Соберите 4 мл образцов периферической крови в пробирку для сбора крови с литиевым гепарином путем венепункции шприцем 22 G и центрифугируйте при 1600 x g в течение 10 мин при 4 °C.
    2. Перелейте надосадочную жидкость в пробирку с безопасным замком объемом 2 мл.
    3. Повторно центрифугируют надосадочную жидкость при 16 000 x g в течение 10 мин при 4 °C, чтобы удалить остатки клеток.
    4. Соберите надосадочную жидкость в новую пробирку с безопасным замком, не повредив гранулу на дне пробирки.
    5. Полученную плазму хранят при температуре −80 °C до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высокопроизводительных результатов с помощью этого анализа требуются образцы хорошего качества. Если используются образцы плазмы, выполните повторное центрифугирование для удаления остаточных клеток. Избегайте многократного размораживания образцов. Используйте гепарин в качестве антикоагулянта, потому что ЭДТА влияет на активность ДНКазы.
  2. Выделение полиморфноядерных нейтрофилов
    1. Соберите образцы периферической крови в пробирку для забора крови с литиевым гепарином путем венепункции шприцем 22 G.
    2. Нанесите 6 мл крови на 6 мл одностадийных полиморфов и центрифугируйте пробирки при концентрации 1000 x g в течение 45 минут при комнатной температуре (RT).
    3. Соберите третий слой охристого слоя, содержащего нейтрофилы, и промойте его три раза в RPMI-1640 без фенола красного цвета в концентрации 400 x g в течение 10 мин при RT.
    4. Ресуспендируйте нейтрофилы в RPMI-1640, не содержащем фенольного красного, содержащем 2 мМ L-глютамина с добавлением 6% инактивированной при нагревании эмбриональной бычьей сыворотки, и подсчитайте клетки в поле микроскопа с помощью гемоцитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод дает чистоту от 96% до 98% с жизнеспособностью более 95%, что оценивается путем исключения трипанового синего красителя.
  3. Активация полиморфноядерных нейтрофилов и нетоз in vitro
    1. Свежевыделенные полиморфноядерные нейтрофилы разводят до 1 ×10,5 клеток/мл в RPMI-1640, не содержащем фенольного красного, содержащем 2 мМ L-глютамина с добавлением 6% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки, и высевают их в 35-миллиметровые чашки для культивирования.
    2. Для индуцирования НВЛ стимулируют полиморфноядерные нейтрофилы 25 нМ ПМА в течение 4 ч при 37 °C в 5%СО2/95% воздуха.
    3. Через 4 ч инкубации частично переваривают НВЛ, добавляя 0,6 мкг/мл ДНКазы I непосредственно в чашки для культивирования в течение 15 мин при РТ, и останавливают активность ДНКазы I, добавляя 5 мМ ЭДТА.
    4. Соберите среду, содержащую синтезированные НВЛ, и центрифугируйте при 400 x g в течение 10 мин при 4 °C, чтобы удалить клеточный мусор.
    5. Получите надосадочную жидкость из четырех здоровых контрольных групп, смешайте и храните при температуре −80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНКаза-переваренные ПМА-стимулированные нейтрофилы, полученные из четырех здоровых контрольных групп, используются в качестве стандарта NET:1,14,15. Постройте калибровочную кривую на основе последовательно разбавленного стандарта NET с помощью PBS и присвойте значения оптической плотности (OD), полученные из неразбавленного стандарта NET, как 100% NET.

3. Метод анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы проведения анализа подробно описаны ниже.

  1. День 1
    1. Нанесите в общей сложности 100 мкл разбавленного анти-MPO или анти-NE антитела, содержащего 0,05 мкг антитела, на каждую лунку планшета, включая пустую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер покрытия не должен содержать какого-либо моющего средства, потому что в противном случае антитела могут не связываться одинаково и гладко со стенками каждой лунки. Чтобы предотвратить эффект крюка, концентрация белка покрытия не должна превышать 20 мкг/мл, поскольку концентрации выше этого уровня будут насыщать большинство доступных участков на микротитровой пластине. Типичный диапазон концентраций белковых покрытий составляет 2-10 мкг/мл. Для предварительного эксперимента вместо специфических моноклональных антител против МПО используют разбавленное контрольное антитело изотипа IgG кролика для покрытия. Используйте разбавленные контрольные антитела изотипа IgG1 мыши для покрытия вместо специфических моноклональных антител против НЭ.
    2. Накройте планшет клейкой пластиковой крышкой, чтобы предотвратить испарение образца, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C, чтобы обеспечить связывание захватных антител.
  2. День 2
    1. Разбавленный раствор антител выбросьте из лунок, а затем пипеткой 300 мкл промывочного раствора на лунку и повторите эту процедуру промывки три-четыре раза.
    2. Удалите излишки PBS, постукивая тарелкой насухо бумажным полотенцем.
    3. Закройте каждую лунку планшета ИФА 200 мкл блокирующего буфера.
    4. Плотно накройте планшет клейкой пластиковой крышкой и инкубируйте его в течение 1,5-2 ч при RT, чтобы перекрыть лунки.
    5. Полностью выбросьте блокирующий раствор из лунок, а затем налейте пипеткой 300 мкл промывочного раствора на лунку и повторите эту процедуру промывки три-четыре раза.
    6. Удалите излишки PBS, постукивая тарелкой насухо бумажным полотенцем.
    7. Нанесите в общей сложности 25 мкл плазмы или среды на каждую лунку, кроме пустой лунки, и добавьте 75 мкл PBS в качестве разбавителя, чтобы получить окончательный объем 100 мкл; добавьте 100 мкл PBS в лунку для заготовки.
    8. Затем перемешивают образцы при RT в течение 10 с, помещая пластину на шейкер при 250 об/мин.
    9. Нанести 2 мкл 100-кратно разбавленной ДНКазы I (0,03 мг/мл) на каждую лунку, включая пустую лунку (конечная концентрация ДНКазы I в реакционной смеси: 0,6 мкг/мл).
    10. Запечатайте пластину клейкой пластиковой крышкой и тщательно перемешайте образцы при RT в течение 10 с, поместив пластину на шейкер при 250 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки оптимальных условий для расщепления ДНК при разработке анализа мы инкубировали образцы, содержащие MPO-ассоциированную ДНК пациентов с COVID-19 с 0-0,9 мкг/мл ДНКазы I в течение 15 мин при РТ и использовали планшеты, покрытые специфическим антителом захвата для МПО или контрольным антителом изотипа соответствующего вида.
    11. Инкубируют образцы в течение 15 мин при РТ.
    12. Снимите клейкую пластиковую крышку и нанесите 1 мкл 0,5 М ЭДТА на каждую лунку, чтобы остановить реакцию ДНКазы.
    13. Закройте пластину клейкой пластиковой крышкой и встряхните ее при RT в течение 15 с, поместив ее на шейкер при 250 об/мин.
    14. Затем инкубируют планшет в течение ночи при 4 °C, чтобы белковые компоненты НВЛ прикрепились к захватным антителам.
  3. День 3
    1. Снимите клейкую пластиковую крышку, и выбросьте раствор из лунок.
    2. Полностью вылейте раствор из лунок, а затем налейте пипеткой 300 мкл промывочного раствора на лунку и повторите эту процедуру промывки три-четыре раза.
    3. Нанесите в общей сложности 100 мкл разбавленного пероксидазы-конъюгированного антитела к обнаружению ДНК в каждую лунку.
    4. Плотно закройте планшет клейкой пластиковой крышкой и инкубируйте в течение 1,5 ч при RT.
    5. Полностью вылейте раствор из лунок, а затем налейте пипеткой 300 мкл промывочного раствора на лунку и повторите эту процедуру промывки три-четыре раза.
    6. Аккуратно удалите остатки раствора.
    7. Нанесите в общей сложности 100 мкл раствора подложки ABTS на каждую лунку и накройте пластину клейкой пластиковой крышкой.
    8. Инкубируют планшет в темноте при РТ в течение 20-30 мин на шейкере при 250 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте пластину с интервалом в 5 минут, пока не будут получены желаемые показания наружного диаметра.
    9. Добавьте в общей сложности 50 мкл 2 М серной кислоты, чтобы остановить реакцию.
    10. Перемешайте жидкое содержимое лунок, осторожно постукивая по боковой стороне пластины.
    11. Включите считыватель микропланшетов и подключите его к компьютеру.
    12. Откройте программное приложение на компьютере.
    13. В строке состояния создайте новый эксперимент и присвойте ему имя.
    14. Установите все следующие параметры для считывания пластины: Тип считывания, Поглощение; Режим чтения, конечная точка; Длины волн, 2; Лм-1, 405 нм; Лм-2, 490 нм; Автоматическое микширование и гашение до, Выкл.; Пластина предварительного считывания, выкл.; Автоматическая калибровка, Вкл; Полоски, считывают всю тарелку; Приоритет длины волны столбца, Приоритет столбца; Скорость каретки, нормальная; и Авточтение, Выкл.
    15. Затем поместите 96-луночную пластину с образцами в ящик и закройте его.
    16. Наконец, нажмите кнопку Чтение , чтобы пластина была прочитана немедленно.
    17. Считайте поглощение каждой лунки на длине волны 405 нм с помощью микропланшетного ридера (на этом этапе используйте длину волны 490 нм в качестве эталона).
    18. Выполните автоматическое вычитание значения поглощения только среды для анализа из всех неизвестных образцов и сохраните данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандартную кривую, полученную из последовательно разбавленного NET-стандарта, для расчета относительной концентрации NET в образце 1,14,15. Здесь окончательные результаты представлены в виде «комплексов MPO- или NE-ДНК (% от стандарта NET)». Предел обнаружения (LOD) рассчитывался по стандартному отклонению (SD) и наклону градуировочной кривой (S) следующим образом: LOD = 3,3(SD/S).

4. Статистика

  1. Выполняйте все статистические анализы с помощью соответствующего программного обеспечения для статистического анализа. Здесь был использован SigmaPlot v14.5. Проценты и непрерывные переменные отображаются в виде медианы с межквартильным размахом из-за неравномерного распределения большинства параметров.
  2. Сравните уровни MPO-ДНК и NE-ДНК в плазме крови у пациентов с COVID-19 и здоровой контрольной группы с помощью критерия ранговой суммы Вилкоксона. Используйте корреляционный анализ для изучения взаимосвязи между оптической плотностью и процентным соотношением стандарта NET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом методе использовали сэндвич-ИФА с моноклональными антителами к МПО, анти-НЭ и анти-ДНК для измерения МПО-ассоциированной и НЭ-ассоциированной ДНК (рис. 1). В этом методе лунки микротитровой пластины покрывали МПО-специфическим или НЭ-специфическим моноклональным антителом для захвата ДНК-ассоциированных МПО и ДНК-ассоциированных МПО, а также не-ДНК-ассоциированных МПО и НЭ. Для расчета внутрипробирного коэффициента вариабельности (CV) для 30 образцов, взятых у пациентов с COVID-19 и здоровой контрольной группы, были выполнены повторные измерения в пределах одной пластины, а %CV рассчитывали как среднее арифметическое повторяющихся измерений; для расчета межпромежуточного CV (т.е. консистенции от планшета к планшету) два типа образцов от пациентов с COVID-19 и здоровой контрольной группы были измерены в четырехкратном размере на 10 различных планшетах; для демонстрации специфичности данного анализа определяли различные концентрации комплексов МПО-ДНК и НЭ-ДНК с использованием планшетов, покрытых контрольными антителами изотипа вместо специфических моноклональных антител против МПО и НЭ; Для расчета чувствительности и линейности анализа был проанализирован серийно разбавленный NET-стандарт, полученный путем стимуляции изолированных нейтрофилов человека PMA и мягким расщеплением ДНКазы, а также рассчитаны коэффициент корреляции и предел обнаружения (LOD).

Калибровочные кривые для MPO-ДНК и NE-ДНК, полученные из последовательно разбавленного стандарта NET, показаны на рисунке 2. Достоверные стандартные кривые для MPO-ДНК и NE-ДНК (R2 = 0,958 и 0,963 соответственно) получаются, когда значения абсорбции не превышают концентраций 0,93 и 0,90 соответственно. Значения LOD, рассчитанные по стандартному отклонению и наклону калибровочной кривой, составили 0,132% и 0,126% для MPO-DNA и NE-DNA (стандарт %net) соответственно.

Наибольший ОД был получен при применении 0,6 мкг/мл ДНКазы I (рис. 3). Таким образом, расщепление ДНК ограничивалось добавлением реакционной смеси ДНКазы I в дозе 0,6 мкг/мл в течение 15 мин при комнатной температуре. При покрытии планшетов контрольным антителом изотипа вместо специфического моноклонального антитела против МПО при различных концентрациях ДНКазы I были выявлены очень низкие значения ОД (<0,09 единиц поглощения [AU]).

Для расчета внутрипробного коэффициента вариабельности (CV) для МПО-ДНК и НЭ-ДНК были проведены повторные измерения в 30 образцах от пациентов с COVID-19 и здоровой контрольной группы в одной и той же пробирке; %CV вычислялось с использованием повторяющегося среднего. Внутрипробные CV для MPO-ДНК и NE-ДНК составили 1,871 и 0,987 соответственно у здоровых людей и 2,532 и 2,010 соответственно у пациентов с COVID-19 (табл. 1). Средние внутрипробные CV MPO-ДНК и NE-ДНК составили 2,202 ± 0,467 и 1,497 ± 0,723 соответственно (среднее ± стандартное отклонение) (табл. 1).

Для расчета межтестового CV для MPO-ДНК и NE-ДНК два типа образцов, взятых у пациентов с COVID-19 и здоровых контрольных групп, были измерены в четыре раза на 10 различных планшетах, чтобы контролировать консистенцию от планшета к планшету. Средние межпробные CV MPO-ДНК и NE-ДНК составили 6,524 ± 2,672 и 4,389 ± 0,923 соответственно (среднее ± стандартное отклонение) (табл. 2).

Для оценки специфичности захватных антител к комплексам МПО-ДНК и НЭ-ДНК исследовали различные концентрации комплексов МПО-ДНК и НЭ-ДНК с использованием планшетов, покрытых контрольными антителами изотипа вместо специфических моноклональных антител против МПО и НЭ. Из таблицы 3 видно, что контрольные антитела изотипа мало реагировали с комплексами МПО-ДНК и НЭ-ДНК при различных концентрациях (от 0,035 до 0,078 АЕ и от −0,007 до 0,096 АЕ. соответственно).

Уровни MPO-ДНК и NE-ДНК в надосадочной жидкости нейтрофилов, расщепленных ДНКазой, стимулированных PMA, были определены как 100% NET-стандарт, а данные образцов плазмы были выражены как %NET-стандарт. Уровни МПО-ДНК (%NET-стандарт) были достоверно выше в плазме крови пациентов с COVID-19 (n = 16; 29,1% [IQR, 25,8, 41,5]), чем в плазме здоровой контрольной группы (n = 10; 13,4% [IQR, 12,4, 14,8]), как и уровни NE-ДНК (%NET-стандарт) (46,4% [IQR, 32,7, 53,7] против 12,1% [IQR, 9,9, 14,7], соответственно, P < 0,01; Рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1: Основные этапы метода сэндвич-иммуноферментного анализа для измерения ДНК миелопероксидазы или ДНК нейтрофильной эластазы в образцах. (А) Лунки покрыты антителом захвата антимиелопероксидазы (МПО) или антинейтрофильной эластазы (НЭ). (Б) Оставшиеся сайты связывания с белками блокируются блокирующими агентами. (C) Добавляются образцы, содержащие NE-конъюгированную и MPO-конъюгированную ДНК. (D) Проводится ограниченное разложение ДНКазы, и образец инкубируется в лунках для связывания с захватным антителом. (E) Добавляется вторичное антитело к ДНК, меченное пероксидазой. (F) Несвязанное вторичное антитело к ДНК, меченное пероксидазой, удаляется. (G) Добавляют субстрат 2,2'-азино-бис (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту) и контролируют развитие цвета. Сокращения: ABTS = 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота); МПО = миелопероксидаза; NE = нейтрофильная эластаза Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Линейность зависимостей между значениями интенсивности и различными разведениями стандарта внеклеточной ловушки нейтрофилов. Надосадочную жидкость нейтрофилов, стимулированных ДНКазой форбол-12-миристат-13-ацетатом, последовательно разбавляли, а уровни миелопероксидазной ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК анализировали для построения калибровочной кривой. Единицы поглощения (AU), полученные из неразбавленного стандарта внеклеточной ловушки нейтрофилов (стандарт NET), были определены как 100% NET, а построение графика значения интенсивности на длине волны 405 нм в сравнении со стандартом %NET выявило линейную зависимость. Сокращения: МПО = миелопероксидаза; NE = нейтрофильная эластаза; NET = внеклеточная ловушка нейтрофилов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Доза-реакция ДНКазы I при расщеплении ДНК во внеклеточной ловушке нейтрофилов. Образец вводили в лунки, покрытые миелопероксидазой. Затем добавляли ДНКазу I (0 мкг/мл, 0,3 мкг/мл, 0,6 мкг/мл или 0,9 мкг/мл). Через 15 мин пищеварения активность фермента прекращали, и соответственно выполняли оставшиеся этапы сэндвич-ферментного иммуноферментного анализа. Данные представлены в виде среднего ± SD. N = 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Уровни в плазме крови комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК у пациентов с COVID-19. Данные выражаются в процентах от стандартного содержания внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET-стандарта) и представляются в виде медиан и межквартильных диапазонов. Пациенты с COVID-19, n = 16; Здоровый контроль, n = 10. ** P < 0,01 по сравнению со здоровой контрольной группой. Сокращения: HC = здоровый контроль; NET = внеклеточная ловушка нейтрофилов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Внутрипробирный коэффициент изменчивости. Тридцать образцов измеряли в двух экземплярах для контроля индивидуальных коэффициентов изменчивости и, таким образом, определения внутрипробного коэффициента вариабельности. Сокращения: AU = единицы поглощения; CV = коэффициенты изменчивости Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Межпробирный коэффициент изменчивости. Образцы были измерены в квадрупликации на 10 различных планшетах для мониторинга вариаций от пластины к пластине и, таким образом, определения межпробного коэффициента изменчивости. Сокращения: AU = единицы поглощения; CV = коэффициент изменчивости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Тест на специфичность для захвата антител. Планшеты покрывали контрольными антителами изотипа к антимиелопероксидазе (МПО) и антинейтрофильной эластазе (НЭ) для оценки специфичности захватных антител к комплексам МПО-ДНК и НЭ-ДНК. Сокращения: AU = единицы поглощения; МПО = миелопероксидаза; NE = нейтрофильная эластаза Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нами описан метод сэндвич-ИФА, при котором МПО или НЭ связываются с одним сайтом захватного антитела при первичной инкубации образцов, содержащих комплексы МПО-ДНК или НЭ-ДНК. После промывки «бутерброд» завершается инкубацией образцов с пероксидаза-ассоциированным анти-ДНК моноклональным антителом. После удаления несвязанного вторичного антитела связанный конъюгат пероксидазы обнаруживается путем добавления хромогенного субстрата ABTS-пероксидазы, в результате чего получается растворимый конечный продукт, который может быть прочитан спектрофотометрически при длине волны 405 нм. Хорошая линейность и высокая точность между анализами и внутритестами указывают на то, что ИФА-анализ, описанный в этой статье и других 1,2, является надежным и осуществимым для клинического применения. Кроме того, когда надосадочная жидкость нейтрофилов, стимулированных ПМА, обработанных ДНКазой, назначается в качестве максимального сигнала для NET-стандарта, этот ИФА-анализ может быть использован в качестве полуколичественного метода 1,14,15.

Длинные нити хроматина НВЛ украшены белками MPO и NE. Для усиления связывания между захватным антителом и комплексами MPO-ДНК или NE-ДНК нити разрезают на более короткие кусочки путем ограниченного расщепления ДНК ферментом ДНКазой; добавление слишком высокой концентрации ДНКазы может привести к чрезмерному перевариванию ДНК и, таким образом, снижению абсорбции. Результаты предварительного эксперимента (см. рис. 3) показали, что для разрыхления остатков, полученных из НВЛ, необходимо соответствующее количество добавления ДНКазы. Эксперименты, в которых использовались контрольные антитела изотипа вместо специфических захватных антител, показали, что антитела захвата, используемые в этом анализе, были специфичны для комплексов MPO-ДНК и NE-ДНК.

Ранняя стадия образования НВЛ характеризуется деконденсированным хроматином и сохранением интенсивности плазматической мембраны 9,16,17. Нейтрофилы с конденсированным ядром были идентифицированы как нейтрофилы, которые подвергаются образованию НВЛ и могут быть количественно определены с помощью проточной цитометрии10. Несмотря на то, что проточная цитометрия позволяет анализировать большое количество изображений клеток за короткое время, она не может быть использована для оценки более поздних стадий образования НВЛ после разрыва клеточной мембраны и экструзии хроматина. Цитруллинированные гистоны H3, которые, как известно, являются НВЛ-специфическими маркерами, могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга18 и ИФА19; однако эти методы специфичны только для формирования НВЛ, связанных с PAD4, и не могут быть использованы для оценки НВЛ, независимых от PAD420.

Вывод о том, что уровни остатков НВЛ в сыворотке крови были выше у пациентов с COVID-19, чем в здоровой контрольной группе, согласуется с предыдущими сообщениями21,22. Эти данные свидетельствуют о том, что активация нейтрофилов, включая образование НВЛ, может играть важную роль в патогенезе COVID-19.

Этот анализ имеет ограничение. Недавние исследования показали, что иммунозависимые гены, включая MPO и ELANE, которые кодируют MPO и NE соответственно, высоко экспрессируются при неконтролируемых воспалительных состояниях23 и положительно коррелируют с тяжестью заболевания и смертностью24. Поскольку МПО и НЭ участвуют в образовании НВЛ независимо от этих ферментативных активностей15, повышенные уровни белков НЭ и МПО в нейтрофилах могут повлиять на результаты этого анализа.

Мы пришли к выводу, что этот метод сэндвич-ИФА напрямую измеряет внеклеточную ДНК с гранулярными белками, включая NE и MPO, которые специфичны для образования НВЛ. Этот детектирующий анализ является надежным, высокочувствительным и полезным методом для исследования характеристик НВЛ в образцах человека и надосадочной жидкости культуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Все данные, полученные и/или проанализированные в ходе данного исследования, включены в данную опубликованную статью. Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-ра Хука Мухаммада Аминула за помощь в рецензировании рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

Иммунология и инфекционные заболевания выпуск 195
Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter