Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול למערכת טרנסגנזה מודולרית Tol2, שיטת שיבוט מבוססת שער ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים לעוברים של דגי זברה.
Abstract
הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מאופיינות במערך משתנה מאוד של פגמים מבניים וליקויים קוגניטיביים הנובעים מחשיפה לאתנול לפני הלידה. בשל הפתולוגיה המורכבת של FASD, מודלים של בעלי חיים הוכיחו את עצמם כקריטיים להבנתנו הנוכחית של פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול. דגי זברה הוכיחו את עצמם כמודל רב עוצמה לבחינת פגמים התפתחותיים הנגרמים על ידי אתנול בשל רמת השימור הגבוהה הן של גנטיקה והן של התפתחות בין דגי זברה לבני אדם. כמערכת מודל, לדגי זברה יש תכונות רבות שהופכות אותם לאידיאליים למחקרים התפתחותיים, כולל מספר רב של עוברים מופרים חיצונית שהם ניתנים למשיכה גנטית ושקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט במדויק על העיתוי והמינון של חשיפה לאתנול בהקשרים גנטיים מרובים. אחד הכלים הגנטיים החשובים הזמינים בדגי זברה הוא טרנסגנזה. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים והקמת קווים טרנסגניים יכולה להיות מורכבת וקשה. כדי להתמודד עם בעיה זו, חוקרי דגי זברה הקימו את מערכת הטרנסגנזה Tol2 המבוססת על טרנספוזון. מערכת מודולרית זו משתמשת בגישת שיבוט שער מרובה אתרים להרכבה מהירה של מבנים טרנסגניים שלמים מבוססי טרנספוזון Tol2. במאמר זה אנו מתארים את ארגז הכלים הגמיש של מערכת Tol2 ופרוטוקול ליצירת מבנים טרנסגניים המוכנים לטרנסגנזה של דגי זברה והשימוש בהם במחקרי אתנול.
Introduction
חשיפה לאתנול טרום לידתי מולידה רצף של ליקויים מבניים וליקויים קוגניטיביים המכונים הפרעות ספקטרום אלכוהול עוברי (FASD)1,2,3,4. היחסים המורכבים בין גורמים מרובים הופכים את לימוד והבנת האטיולוגיה של FASD בבני אדם למאתגרים. כדי לפתור את האתגר הזה, נעשה שימוש במגוון רחב של מודלים של בעלי חיים. הכלים הביולוגיים והניסיוניים הזמינים במודלים אלה הוכיחו את עצמם כחיוניים לפיתוח הבנתנו את הבסיס המכניסטי של טרטוגניות אתנול, והתוצאות ממערכות מודל אלה תואמות להפליא את מה שנמצא במחקרי אתנול אנושיים 5,6. בין אלה, דגי זברה התפתחו כמודל רב עוצמה לחקר אתנול טרטוגנזה7,8, בין היתר בשל ההפריה החיצונית שלהם, פריון גבוה, יכולת משיכה גנטית ועוברים שקופים. עוצמות אלה משתלבות והופכות את דגי הזברה לאידיאליים למחקרי הדמיה חיים בזמן אמת של FASD באמצעות קווי דגי זברה טרנסגניים.
דגי זברה טרנסגניים שימשו באופן נרחב לחקר היבטים רבים של התפתחות עוברית9. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים וקווים טרנסגניים הבאים יכולה להיות קשה מאוד. טרנסגן סטנדרטי דורש אלמנט מקדם פעיל כדי להניע את הטרנסגן ואות פולי A או "זנב", כולם בווקטור חיידקי יציב לתחזוקה וקטורית כללית. הדור המסורתי של מבנה מהונדס מרובה רכיבים דורש שלבי שיבוט משנה מרובים הגוזלים זמן רב10. גישות מבוססות PCR, כגון הרכבת גיבסון, יכולות לעקוף חלק מהבעיות הקשורות לשיבוט משנה. עם זאת, פריימרים ייחודיים חייבים להיות מתוכננים ונבדקים עבור הדור של כל מבנה מהונדס ייחודי10. מעבר לבניית טרנסגנים, אינטגרציה גנומית, העברת תאי נבט וסינון לאינטגרציה טרנסגנית תקינה היו קשים גם כן. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לשימוש במערכת טרנסגנזה מבוססת טרנספוזון Tol2 (Tol2Kit)10,11. מערכת מודולרית זו משתמשת בשיבוט שער מרובה אתרים כדי ליצור במהירות מבנים טרנסגניים מרובים מספרייה הולכת ומתרחבת של וקטורי "כניסה" ו"יעד". אלמנטים משולבים הניתנים לטרנספוזיה Tol2 מגבירים מאוד את קצב הטרנסגנזה, ומאפשרים בנייה מהירה ואינטגרציה גנומית של טרנסגנים מרובים. באמצעות מערכת זו, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש ביצירת קו דגי זברה טרנסגניים של אנדודרם כדי לחקור את הפגמים המבניים הספציפיים לרקמות העומדים בבסיס FASD. בסופו של דבר, בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההתקנה המודולרית והבנייה של מבנים טרנסגניים יסייעו מאוד למחקר FASD מבוסס דגי זברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל עוברי דגי הזברה המשמשים בהליך זה גודלו וגודלו בעקבות פרוטוקולים שנקבעו12 של IACUC. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת לואיוויל.
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בזן דגי הזברה מסוג בר, AB וקו מוטנטי כפול bmp4st72;smad5b1100 . כל המים ששימשו בהליך זה היו מי אוסמוזה הפוכה סטרילית. תמונות קונפוקליות צולמו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. מדידות האנדודרם נעשו באמצעות כלי המדידה ב-ImageJ. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנות סטטיסטיות.
1. ביצוע הפתרונות והמדיה
- מדיה חיידקית: להמיס ציר LB או אגר לפי הוראות היצרן, ו autoclave. לפני מזיגת המדיה לצלחות פטרי 100 מ"מ, הוסיפו אמפיצילין (50 מיקרוגרם/מ"ל), קנמיצין (50 מק"ג/מ"ל), או שילוב של אמפיצילין/כלוראמפניקול (50 מק"ג/מ"ל ו-30 מק"ג/מ"ל, בהתאמה).
- כדי ליצור מלאי מדיה עוברית פי 20x, יש להמיס את הפריטים הבאים ב-1 ליטר מים: 17.5 גרם NaCl, 0.75 גרם KCl, 2.9 גרם CaCl 2, 0.41 גרם של K 2 HPO 4, 0.142 גרם של Na 2 HPO 4 ו-4.9 גרם של MgSO4·7H 2O. סנן-עיקור תמיסת המלאי באמצעות מערכת סינוןואקום 0.22 מיקרומטר, ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
הערה: התעלם מהשקע הלבן שנוצר; זה לא ישפיע על התקשורת. - ב 19 L של מים, להמיס 1.2 גרם של NaHCO3 ולהוסיף 1 L של מלאי מדיה עובר 20x כדי ליצור את פתרון מדיה עובר עובד, ולשמור על תמיסה זו ב 28 ° C.
- לתמיסה 2% פנול אדום, יש להמיס 20 מ"ג של מלח נתרן אדום פנול ב-1 מ"ל מים נטולי RNase, ולאחסן בטמפרטורת החדר.
2. תבניות הזרקת עוברים
- להכנת צלחת הזרקת האגרוז, ממיסים את האגרוז במצע העוברי לריכוז סופי של 3% על ידי חימום לרתיחה.
- יוצקים 50 מ"ל אגרוז לתוך צלחות פטרי 100 מ"מ, ובזמן שהאגרוז עדיין נוזלי, מניחים בעדינות את תבנית ההזרקה באגרוז כדי למנוע היווצרות בועות מתחת לתבנית.
- תנו לצלחות האגרוז להתקרר. ברגע שהאגרוז מוצק, מסירים את תבנית ההזרקה ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C עד שהיא מוכנה לשימוש.
3. פיפטות הזרקה
- משוך נימים בקוטר 1.0 מ"מ (OD) המכילים חוט להט לתוך מחטים באמצעות מושך פיפטה אנכי כאשר הסולנואיד מוגדר ל-2.5 וגוף החימום מוגדר ל-14.6.
הערה: כל מושך מחומם יעבוד אם הוא מושך את הנימים לשתי מחטים בצורה נקייה ושווה, אך יש למשוך את מחטי ההזרקה תוך שבוע מהזרקת עוברי דגי הזברה לקבלת תוצאות הזרקה עקביות.- מניחים את הנימים במושך, מהדקים את המהדק בכל קצה, ולאחר מכן מפעילים את גוף החימום.
- משוך את הנימים כדי ליצור שתי מחטי הזרקה.
- מוציאים את הנימים מהמושך ומאחסנים אותם בצלוחית פטרי ריקה עם רצועה של חימר דוגמנות המשמש כמחזיק המחט.
4. הכנת mRNA טרנספוזאז
- לינארית פלסמיד Tol2Kit המכיל טרנספוזאז עם אנדונוקלאז הגבלה NotI על ידי שילוב הדברים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מ"ל: 10 μL של פלסמיד transposase (150 ng/μL), 1.5 μL של חיץ תגובה endonuclease הגבלה, 0.3 μL של NotI endonuclease.
- מלא את התגובה עד 20 μL עם מים ללא RNase, ולאחר מכן לערבב ולעכל ב 37 ° C במשך הלילה.
- עצור את עיכול transposase על ידי הוספת 1 μL של 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 μL של 5 M NH4OAc, ו 80 μL של 100% EtOH לתגובת העיכול, ולאחר מכן לערבב ולצנן ב -20 ° C במשך הלילה.
- צנטריפוגה את התמיסה ב 14,000x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת DNA במים נטולי RNase.
- קבע את ריכוז הפלסמיד הליניארי בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) באמצעות פלואורומטר על ידי הפעלה תחילה של 2 μL של מים ריקים ללא RNase ולאחר מכן הרצת 2 μL של פלסמיד ליניארי.
הערה: ריכוזי הפלסמיד נעים בדרך כלל בין 100-200 ננוגרם/מיקרוליטר - הגדר את ייצור ה-mRNA SP6 על-ידי שילוב הרכיבים הבאים בסדר בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל: 10 μL של 2x NTP/CAP, 2 μL של 10x מאגר תגובה, 0.1-1 מיקרוגרם של תבנית DNA ליניארית ו-2 μL של תערובת אנזימים SP6.
- מלא את התגובה עד 20 μL עם מים ללא RNase, ולאחר מכן לערבב ולדגור ב 37 ° C במשך 2 שעות.
- לאחר הדגירה במשך שעתיים, יש להוסיף 1 μL של DNase, לערבב היטב ולדגור במשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 37°C.
- כדי לעצור את תגובת SP6, הוסף 30 μL של תמיסת משקעים LiCl לצינור התגובה, ולאחר מכן ערבב והתקרר ב -20 ° C למשך הלילה.
- צנטריפוגה את התמיסה ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי pellet mRNA, ולאחר מכן לשאוף את supernatant ולשטוף את כדור mRNA עם 1 מ"ל של 80% EtOH (מדולל עם מים נטולי RNase).
- צנטריפוגה את התמיסה ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C כדי לשאוף את mRNA, ולאחר מכן לשאוף את supernatant. הניחו לגלולה להתייבש באוויר.
- להשהות מחדש את כדורית ה-mRNA ב-20 μL של מים נטולי RNase, לקבוע את ריכוז ה-mRNA בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) באמצעות פלואורומטר כמתואר בשלב 4.5 (צריך להיות לפחות 100 ng/μL), aliquot 100 ng של mRNA לכל צינור לשימוש יחיד, ולאחסן ב-80°C.
הערה: כדי לוודא שה-mRNA אינו מתפרק, ניתן להפעיל במהירות 2 μL של mRNA על אלקטרופורזה של DNA כדי לאשר פס יחיד במהירות של 1,950 bps.
5. שיבוט שער מרובה אתרים ליצירת וקטורי כניסה לטרנסגנזה
הערה: פרוטוקול זה שונה מ- Kwan et al.10, כאשר תגובת LR כתובה כתגובת חצי LR ובנפח כולל של 5 μL. כדי ליצור רכיבי כניסה חדשים, יש להשתמש בתגובות BP המשתמשות בווקטורי תורם של 5', אמצע ו-3'10,13.
- כדי לבצע את התגובה, אסוף 10 fmol כל אחד של p5E, pME ו- p3E ו- 20 fmol של וקטור היעד (pDest).
הערה: רקומבינציית LR מרובת אתרים משתמשת בארבעה וקטורי פלסמיד שונים: וקטור כניסה 5' (p5E), וקטור כניסה אמצעי (pME), וקטור כניסה 3' (p3E) וקטור יעד (pDest), כדי ליצור מבנה מהונדס ייחודי שמשני צדדיו חזרות Tol2 המוכנות להזרקה לעוברים של דגי זברה.- זהה את גודלם של כל ארבעת הווקטורים בזוגות בסיסים ממקור הפלסמיד (טבלה 1, Tol2Kit Wiki עמוד14 או Addgene11; ראה טבלת חומרים).
הערה: עבור וקטורים חדשים, ריצוף פלסמיד מלא באמצעות חברות ריצוף מסחריות יכול לספק את גודל הפלסמיד המדויק ב- bps. - קבע את הריכוז של כל ארבעת הווקטורים בננוגרם למיקרוליטר (ng/μL) באמצעות פלואורומטר, כמתואר בשלב 4.5.
- באמצעות משקל הדנ"א כ-660 גרם/מול וגודל הפלסמיד (ב-bps), חשב את סך הננוגרמים (ng) של פלסמיד הדרוש כדי להגיע ל-10 fmol (וקטורי כניסה) או 20 fmol (וקטור יעד).
הערה: מעבדת Mosimann באוניברסיטת קולורדו, קמפוס רפואי אנשוץ, יצרה גיליון אלקטרוני זמין באופן חופשי כדי לחשב את כמות הפלסמיד הדרוש (ב- ng) ואת הנפח (ב- μL) של הווקטורים הדרושים בתגובת LR15.
- זהה את גודלם של כל ארבעת הווקטורים בזוגות בסיסים ממקור הפלסמיד (טבלה 1, Tol2Kit Wiki עמוד14 או Addgene11; ראה טבלת חומרים).
- כדי ליצור את המבנה המתואר להלן, sox17: EGFPCAAX, השתמש בווקטורים הבאים: וקטור p5E המכיל את מקדם דג הזברה sox17 , שהוא 6,918 bp בגודל16; וקטור pME המכיל את ה-EGFP הפרנילטי, שהוא 3,345 bp בגודל10; וקטור p3E המכיל את רצף האותות SV40 late poly A, שהוא 2,838 bp בגודל10; ואת pDest, שהוא 5,883 bp בגודל10.
- באמצעות ריכוז הפלסמיד שנקבע בשלב 5.1.2 והכמות בננוגרם (ng) עבור כל וקטור (שלב 5.1.3), חשב את סך המיקרוליטרים (μL) של כל פלסמיד הדרוש כדי להגיע ל- 10 fmol (וקטורי כניסה) או 20 fmol (וקטור יעד), ולאחר מכן חלק זאת בשניים לשימוש בתגובות 5 μL חצי LR (כל הערכים המפורטים להלן מפורטים בטבלה 2).
- כדי לייצר 10 fmol של p5E-sox17, יש להשתמש ב-45.66 ng (בריכוז של 140.3 ng/μL) ולדלל במים סטריליים פי 4 כדי לקבל 0.65 μL.
- כדי לייצר 10 fmol של pME-EGFPCAAX, יש להשתמש ב-22.08 ng (בריכוז של 213.5 ng/μL) ולדלל במים סטריליים פי 10 כדי לקבל 0.52 μL.
- כדי לייצר 10 fmol של p3E-poly A, יש להשתמש ב-15.73 ng (בריכוז של 276.1 ng/μL) ולדלל במים סטריליים פי 20 כדי לקבל 0.57 μL.
- עבור 20 fmol של וקטור היעד, השתמש 77.66 ng של pDest (בריכוז של 307.3 ng / μL) ודלל עם מים סטריליים על ידי פקטור של 5 כדי לקבל 1.63 μL.
- כדי להגדיר תגובת 5 μL חצי LR, שלב את נפחי p5E, pME, p3E ו- pDest שנקבעו בשלב 5.3 בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל, ולאחר מכן הוסף מים סטריליים כדי להגיע לנפח תגובה כולל של 4 μL.
- מערבבים במרץ את תערובת האנזים LR 2x למשך דקה אחת כל אחד כדי להבטיח ערבוב תקין, ולאחר מכן מוסיפים 1 μL לתגובה ומערבבים היטב.
- יש לדגור ב-25°C למשך הלילה (16+ שעות).
- עצור את תגובת LR על ידי הוספת 0.5 μL של proteinase K (2 מיקרוגרם / μL), לדגור ב 37 ° C במשך 10 דקות, ולאחר מכן לקרר לטמפרטורת החדר.
- הפוך 3-4 μL של פלסמיד לתאים מופשרים בעלי כשירות כימית על ידי הוספת הפלסמיד ולתת לתאים לשבת על קרח במשך 25-30 דקות.
- בזמן שהתאים יושבים על קרח, חממו שתי צלחות אגר LB-ampicillin לטמפרטורת החדר.
- הלם חום את התאים באמבט מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות בדיוק.
- לאחר הלם החום, יש להוסיף לתאים 250 מיקרוליטר של מדיה נוזלית עשירה ונטולת אנטיביוטיקה, ולדגור עם רעידות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה וחצי.
- יש לפזר 300 מיקרוליטר חיידקים על צלחת אמפיצילין אחת, ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
- למחרת בבוקר, בדקו את המושבות לנוכחות שני פנוטיפים, שקופים ואטומים, בחרו את המושבות השקופות (כמתואר בקוואן ואחרים 10) אחת בכל פעם, חסנו את התרבית הנוזלית, ואז נערו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: מושבות שקופות מכילות כמעט תמיד את מושבת LR הנכונה (>85% מהמקרים). - באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן, בצע הכנת פלסמיד על כל תרבית נוזלית, ועכל באופן מאבחן כל פלסמיד כדי לאשר את הגודל המתאים של המבנה המהונדס, מה שמצביע על כך שתגובת שער LR פעלה כראוי.
- התמירו מחדש את המבנים הטרנסגניים הנכונים באמצעות פרוטוקול הטרנספורמציה החיידקי הסטנדרטי כמתואר בשלבים 5.4-5.12 באמצעות 0.5-1 μL של הפלסמיד, ודגרו רק בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
- פסו מחדש את המושבות, ואשרו שלכל אחת מהן יש מבנה מהונדס LR כמו בשלב 5.14.
- קבע את ריכוז הפלסמיד כמתואר בשלב 4.5 (לפחות 150 ננוגרם/מיקרוליטר נדרשים להזרקת העובר).
6. הזרקת הטרנסגן לעוברים
- הפשירו דגימת mRNA טרנספוזאז חד-פעמית ומבנה מהונדס Tol2 על קרח והזהירו מראש צלחת הזרקת אגרוז לטמפרטורת החדר.
- ערבבו את הדברים הבאים על קרח: 150 ננוגרם פלסמיד, 100 ננוגרם mRNA טרנספוזאז ו-2% פנול אדום (0.3 מיקרוליטר). לאחר מכן, הוסף מים נטולי RNA כדי להשלים את הנפח ל -3 μL.
- העבירו עוברים בשלב התא באמצעות פיפטות העברה לצלחת ההזרקה (המתוארת בשלב 2) מלאות בקרינה אלקטרומגנטית המכסה לחלוטין את האגר, ולאחר מכן לחצו בעדינות על כ-50-75 עוברים לכל חריץ של צלחת ההזרקה.
- הוסף את תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדומה לקצה הפתוח של מחט הזרקה נימית, מקם את מחט הנימים בבית השחי של מתקן ההזרקה, והפעל את מתקן ההזרקה.
הערה: מתקן ההזרקה משתמש בגז דחוס, כגון אוויר, כדי לפעום את הנפח הרצוי (המתואר בשלב 6.5) של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדום לתוך העובר כאשר הוא מופעל. - הורידו את המחט הנימית לתוך ה-EM של צלחת ההזרקה, ושברו את הקצה באמצעות מלקחיים כדי לאפשר רק כמות קטנה של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדומה להישאב החוצה על ידי מתקן ההזרקה.
- הזריקו לעוברים בולוס קטן של 3 nL של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדום לגוף התא של העובר.
הערה: בולוס 3 nL הוא נפח של תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדום שבו שבעה בולוסים יכולים תיאורטית להתאים באופן שווה על פני קו האמצע של העובר. - בסיום הזרקת העוברים, הוציאו אותם מצלחת ההזרקה על ידי הוצאתם בעדינות מהחריץ והעברתם לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ עם EM טרי (כ-40 מ"ל), ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לעוברים להתפתח.
7. בדיקת עוברים להחדרה מהונדסת
- לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים, יש לבחור את השלב ההתפתחותי המתאים בו יש לבטא את הטרנסגן הפלואורסצנטי, ולסנן נוכחות פלואורסצנטית תחת מיקרוסקופ מנתח פלואורסצנטי.
הערה: עוברים אלה יהיו פסיפס בביטוי שלהם ויראו החדרה גנומית של המבנה המהונדס. - סינון עבור טרנסגנים שאינם פלואורסצנטיים על ידי סינון עבור סמן טרנסגני פלואורסצנטי (כמתואר בשלב 7.1), כגון GFP המונע על ידי מקדם ספציפי ללב עבור הגן cmlc2 או mCherry מונע על ידי מקדם ספציפי לעדשה של αcyrstallin, אשר כלולים וקטורי יעד נפרדים.
- לאפשר לעוברים החיוביים להחדרה טרנסגנית להתפתח במלואם לשלבי דג הזברה הבוגר.
- ברגע שדגים טרנסגניים פוטנציאליים מגיעים לגיל הרבייה, סנן אותם בנפרד הן להעברת קו הנבט והן לביטוי טרנסגני על ידי הרבאתם לדגי זברה מסוג בר.
- אותם מבוגרים שהעוברים שלהם מתפתחים באופן תקין ונותנים את הביטוי הטרנסגני החזק והמתאים ביותר נשמרים כקווי דגי זברה טרנסגניים ייחודיים לעבודה וניתוחים עתידיים.
הערה: כגישה חלופית לסינון החדרה גנומית של מבנים טרנסגניים, תכנן פריימרים PCR שרק מגבירים את המבנה המהונדס ולא DNA מסוג פראי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי ליצור את המבנים הטרנסגניים, השתמשנו במערכת הטרנסגנזה Tol2. שלושה וקטורי כניסה, כולל p5E, המחזיק את האלמנטים מקדם/משפר הגנים, pME, המחזיק את הגן לביטוי על ידי האלמנטים המקדם/משפר, ו-p3E, אשר לכל הפחות, מחזיק את זנב הפוליA, שימשו ליצירת המבנה המהונדס באמצעות שיבוט LR מרובה אתרים. וקטור היעד, pDest, מספק את החזרות של Tol2 להחדרה גנומית של המבנה המהונדס בעוברים של דגי זברה, ומכיל את כל המידע הגנטי החיוני לצמיחת חיידקים (איור 1A). לצורך כתב יד זה, יצרנו והזרקנו מבנה מהונדס sox17:EGFPCAAX . מקדם סמן האנדודרם sox17 שימש להנעת EGFP המתויג כקרום באנדודרם המתפתח של דג הזברה. עבור מבנים טרנסגניים שמבטאים חלבונים שאינם פלואורופורים, וקטור pDest שמכיל סמן מהונדס פלואורסצנטי כמו cmlc2:EGFP יכול לשמש כדי לסייע בהחדרה גנומית (איור 1A).
באמצעות הערכים המתוארים בפרוטוקול לעיל (טבלה 2), נוצר המבנה המהונדס sox17:EGFPCAAX , ו-4 μL של מבנה זה הפכו לתאי Escherichia coli בעלי כשירות כימית. לאחר דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה, צלחת האגר הכילה כ-250 מושבות (תגובות LR בדרך כלל בממוצע 150-300 מושבות לצלחת במעבדה שלנו). הסינון של מושבות אלה בוצע על בסיס אטימות. בידינו, מושבות שהיו שקופות הכילו את מכפלת sox17:EGFPCAAX הנכונה >85% מהזמן, בעוד שהמושבות האטומות מעולם לא הכילו את מכפלת הרקומבינציה הנכונה (איור 1B, ראש חץ לעומת חץ). לאחר בידוד הפלסמיד מכמה מושבות, עיכול ההגבלה של המוצרים הרקומביננטיים בוצע עם אנזים ההגבלה, NcoI. שתי מושבות שקופות שונות ומושבה אטומה אחת עוכלו. לשתי המושבות השקופות הייתה רצועה אחת בגודל הנכון של 9,544 bp (פלסמידים לא מעוכלים שהוטענו כבקרת עיכול), בעוד שלמושבה האטומה לא היו פסים כלל (איור 2A). מבנים חיוביים אלה של sox17:EGFPCAAX השתנו מחדש, המושבות הבאות עברו פסים מחדש, מושבות אלה אושרו כבעלות פלסמיד, ונוצרו מלאי מקפיא חיידקי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הריכוזים הן של פלסמיד sox17:EGFPCAAX והן של mRNA capped-transposase נקבעו כך ששניהם יוכלו לשמש להזרקה (איור 2B).
העוברים הוכנו להזרקה על-ידי הכנסת עוברים בשלב התא לתוך תבנית הזרקת עוברים שחוממה מראש (איור 3A-C). לאחר שהונחה בתבנית ההזרקה, מחט ההזרקה שהכילה את sox17:EGFPCAAX mRNA הונחה במחזיק מיקרופיפטה על המיקרומניפולטור (איור 3D,E). לעוברים הוזרקו 100 ננוגרם של mRNA טרנספוזאז, 150 ננוגרם של פלסמיד sox17:EGFPCAAX ואדום פנול (צבע מעקב הזרקה). בולוס 3 nL (נקבע לפי גודל כמתואר בפרוטוקול, שלב 6.6) הוזרק לגוף התא ולא לחלמון של העובר כדי לקבל את הסיכוי הטוב ביותר להשתלבות (איור 3F)10.
לאחר ההזרקה, העוברים הוצאו מתבנית ההזרקה והורשו להתפתח במשך 24 שעות. 24 שעות לאחר ההפריה (hpf), העוברים נבדקו לביטוי אנדודרם של EGFPCAAX. ביטוי EGFPCAAX של אנדודרם פסיפס נצפה ב~75% מהעוברים המוזרקים (איור 4A,A'). כדי לסנן את העוברים שמוזרקים להם טרנסגנים שאינם פלואורסצנטיים כמו Gal4 או CreERT2, ניתן להשתמש בווקטור יעד שמכיל גם סמן מהונדס (כלומר, cmlc2:EGFP) (איור 1A) (איור 4B,B'). דגי זברה בוגרים עם טרנסגנזה של קו הנבט של sox17:EGFPCAAX יצרו עוברים פלואורסצנטיים כשהאנדודרם מסומן במלואו עם EGFPCAAX (איור 4C).
באמצעות הקו המהונדס החדש שנוצר sox17:EGFPCAAX, הצלחנו להעריך ישירות את ההשפעה של אתנול על היווצרות השקיות האנדודרמליות. השקיות הן בליטות הנוצרות בקצה הלטרלי של האנדודרם וחשובות להיווצרות שלד הפנים ומערכות איברים מרובות17. הראינו בעבר כי חסימת איתות של חלבון מורפוגנטי עצם (Bmp) גורמת להיפופלזיה של השקיות18. כעת אנו מראים כי לטיפול באתנול במוטציות Bmp בין 10-18 HPF יש השפעה עדינה אך משמעותית על גודל השקית. האורך הגבי-גחוני של כל כיס משקיות 1-5 (לדגי זברה יש שש שקיות, אך השישית טרם התגבשה במלואה בשלב ההתפתחותי המצולם) נמדד בעוברי Bmp מוטנטיים מסוג Bmp פראיים שטופלו באתנול (איור 5A). כבקרה על השפעות גדילה כלליות כתוצאה מחשיפה לאתנול, נמדד האורך הקדמי-אחורי של כל האנדודרם (איור 5A). האורך הכולל של האנדודרם לא הושפע מגנוטיפ או מטיפול (איור 5B). עם זאת, שקיות 1 ו-3 הראו עלייה משמעותית באורך השקית בין עוברים פראיים שלא טופלו ועברו אתנול, אך ירדו משמעותית באורכם בין מוטציות Bmp שלא טופלו וטופלו באתנול (איור 5C; ANOVA דו-כיווני; שקיק 1: F(1,54) = 10.39, p = 0.0021; פאוץ' 3: F(1,54) = 12.70, p = 0.0008). פאוץ' 2 הראה עלייה משמעותית בגודל השקית בין קבוצות מוטציות מסוג בר ו-Bmp שטופלו באתנול, בהתאמה (איור 5C; ANOVA דו-כיוונית; F(1,54) = 18.94, p < 0.0001).
איור 1: תגובת שער LR לבניית טרנסגנים. (A) סכמה של תגובת השיבוט המודולרית של שער LR בעלת ארבעה חלקים. LR Clonase משלב מחדש את שלושת וקטורי הכניסה, p5E, pME ו-p3E, ואת וקטור היעד, pDest, בתגובה ספציפית מאוד ליצירת מוצר מהונדס חדשני מוכן להזרקת עובר. לסינון טרנסגנים שאינם פלואורסצנטיים, וקטורי pDest יכולים להכיל סמנים טרנסגניים אופציונליים (cmlc2:EGFP, כדוגמה). (B) מושבות חיידקים לדוגמה המתקבלות מטרנספורמציה של מוצרי רקומבינציה LR. מושבות שקופות הכילו מוצר רקומבינציה LR נכון >85% מהזמן (ראש חץ), בעוד שמושבות אטומות מעולם לא הכילו מכפלת רקומבינציה נכונה (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח של דנ"א פלסמיד וטרנספוזאז mRNA . (A) עיכול אבחוני של שלוש המושבות מטרנספורמציה של מוצרי רקומבינציה LR. המושבה האטומה היחידה לא הכילה פלסמיד למסך, בעוד ששתי המושבות השקופות הכילו רצועה אחת בעוצמה של 9,544 bp (לא חתוכה לעומת חתוכה). (B) טרנספוזאז mRNA ב 1,950 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מערך הזרקת עוברים של דגי זברה. (A) תבנית הזרקה מונחת באגרוז נוזלי מדולל ב-EM (3% v/v). (B) לאחר שהתמצקה, מוציאים את התבנית מצלחת האגרוז. (ג) העוברים מסודרים בתבניות ההזרקה. (ד,ה) תערובת mRNA/פלסמיד/פנול אדומה מוחדרת לתוך מחט ההזרקה, אשר ממוקמת במחזיק המיקרופיפטה במיקרומניפולטור. (F) בולוס 3 nL מוזרק לגוף התא של העובר בשלב התא האחד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הקרנת דגי זברה שהוזרקו להם המבנה המהונדס. (א,א') תמונה קונפוקלית של עובר שצולם ב-24 HPF מראה את ביטוי הפסיפס של טרנסגן sox17:EGFPCAAX. (ב,ב') ביטוי סמן מהונדס של cmlc2:EGFP בלב המתפתח ב 24 hpf. מבט רוחבי על העוברים, עם קדמי משמאל וגבי למעלה. (C) תמונה קונפוקלית של עובר שנוצר מדגי זברה בוגרים נושאי טרנסגן. האנדודרם כולו מבטא EGFPCAAX. מבט רוחבי על העובר, עם קדמי משמאל וגחוני בחלק העליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שקיק נמדד בעוברים מוטנטיים מסוג בר ו-Bmp שטופלו באתנול. (A) סכמטי המראה את מדידת האורך הכולל של האנדודרם ואורך השקיות. (B) המדידות של אורך האנדודרם הקדמי-אחורי הכולל לא מראות הבדל בין עוברים לא מטופלים ועוברים מוטנטיים מסוג אתנול לבין עוברים מוטנטיים מסוג Bmp. (C) המדידות של אורך השקית הגבית-גחונית מצביעות על כך ששקיות 1 ו-3 מראות עלייה באורך השקית בין עוברי הבר שלא טופלו לעוברים פראיים שטופלו באתנול, אך יורדת באורכם בין מוטציות Bmp שלא טופלו לבין מוטציות Bmp שטופלו באתנול (ANOVA דו-כיוונית; שקיק 1: F(1,54) = 10.39, p = 0.0021; פאוץ' 3: F(1,54) = 12.70, p = 0.0008). פאוץ' 2 מראה עלייה באורך בין קבוצות מוטציות מסוג בר שלא טופלו וטופלו באתנול לבין מוטציות Bmp (ANOVA דו-כיוונית; F(1,54) = 18.94, p < 0.0001). לא נצפו הבדלים באורך השקית בין שקיות 4 ו-5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: רכיבי Tol2Kit שוכנים במעבדה היפה. כל וקטור כניסה ויעד הזמין במעבדה היפה, תיאוריהם ומעבדת המוצא שלהם. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: חישוב הכמות והקונצרטציה של כל וקטור בתגובת רקומבינציה LR. הסכום של כל וקטור חושב מהגודל (ב-bp) ומה-fmol הדרוש לכל רכיב: 10 fmol של כל וקטור כניסה ו-20 fmol של וקטור היעד. מריכוז הפלסמיד, כל וקטור מדולל במים סטריליים כדי להוסיף 1 μL או פחות לתגובת LR. מים סטריליים מתווספים לבריכה הווקטורית כדי להיות שווים 4 μL, 1 μL של תערובת תגובת LR מתווסף לתגובה, והוא מודגר ב 25 מעלות צלזיוס במשך הלילה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דגי זברה מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של חשיפה לאתנול על התפתחות ומצבי מחלות 7,8. דגי זברה מייצרים מספר רב של עוברים שקופים, מופרים חיצונית וניתנים למשיכה גנטית, מה שמאפשר הדמיה חיה של מספר רקמות וסוגי תאים המסומנים בטרנסגנים בו זמנית בהקשרים סביבתיים מרובים19,20. חוזקות אלה, בשילוב עם השימור הגנטי ההתפתחותי החזק עם בני אדם, הופכות את דגי הזברה למערכת מודל רבת עוצמה להדמיית ההשפעה של אתנול 7,8. במאמר זה תיארנו את הפרוטוקול לגישה מודולרית ליצירה והזרקה של מבנים טרנסגניים ולהקמת קווי דגי זברה טרנסגניים למחקרים עתידיים באתנול.
גישות רבות ושונות הוקמו ליצירת דגי זברה טרנסגניים. עם זאת, יצירת מבנים טרנסגניים וקווים טרנסגניים יכולה להיות מרתיעה. בעוד שטכניקות מסורתיות של שיבוט משנה, שיבוט BAC או גישות מבוססות PCR כגון הרכבת גיבסון מאפשרות יצירת מבנים טרנסגניים, יש להן תפוקה נמוכה והן חסרות ורסטיליות בבנייה שלהן10. בנוסף, אסטרטגיות אלה צריכות להיות מתוכננות מחדש עבור כל מבנה מהונדס שנוצר. תת-שיבוט דורש עיכול וקשירה מרובים, בהנחה שכל אתרי ההגבלה הדרושים קיימים וייחודיים. שיבוט BAC דורש ריצוף ובדיקה של שיבוטים מרובים של BAC. עבור הרכבת גיבסון, פריימרים חדשים ל-PCR צריכים להיות מתוכננים עבור כל מבנה מהונדס. יתר על כן, הזרקת DNA לא חתוך או ליניארי מוביל להעברת קו נבט נמוך21,22,23.
Tol2Kit היא מערכת מודולרית המשתמשת בשיבוט שערים כדי ליצור מבנים טרנסגניים שלמים הצמודים לחזרות Tol2, שבשילוב עם mRNA טרנספוזאז, מגדילות מאוד את הטרנסגנזה ואת העברת קו הנבט 10,11,24,25. עשרות וקטורי כניסה ויעד זמינים ממעבדת קוואן וממעבדת קול10,11. בנוסף, מעבדות דגי זברה המשתמשות ב-Tol2Kit יצרו ואצרו וקטורים רבים נוספים של כניסה ויעד. כדוגמה לרוחב הווקטורים הזמינים, איגמנו והשתמשנו ביותר מ-70 וקטורים (טבלה 1). עם כל המשאבים הקהילתיים הללו, ניתן ליצור במהירות אלפי מבנים טרנסגניים שונים פשוט על ידי שילוב הווקטורים הנבחרים בתגובת LR.
תגובות LR אופטימליות אכן דורשות חישובים מדויקים של גודל וריכוז הפלסמיד. החישובים עבור כל וקטור נעשים בערכי femtomole (fmol), ולכן כל תגובה אינה דורשת נפח פלסמיד גבוה כדי ליצור מבנה מהונדס. עם זאת, כמות קטנה זו של פלסמיד הופכת את הדילולים ואת הצנרת הנכונה לקריטיים ביותר להצלחת התגובה10. גורמים נוספים שיכולים להשפיע על תגובת LR הם גודל התוספות בווקטורי הכניסה השונים. לדוגמה, אלמנט p5E-sox17 המשמש במחקר זה הוא מעל 4 kb, אשר, אם בשילוב עם אלמנטים pME ו- p3E גדולים באותה מידה, יביא לווקטור מהונדס גדול מאוד. פלסמיד גדול בחיידקים יכול להיות קשה לתרבית, ובכך להקטין את מספר המושבות הנוצרות מהטרנספורמציה החיידקית. זה גם יגרום לצמיחה איטית יותר ורמות פלסמיד נמוכות יותר כאשר מבודדים10. חשוב לציין, שיש תאי חיידקים מוכשרים מאוד, כמו גם הגדלת הדגירה של תאי החיידקים במהלך השינוי של פלסמיד רקומבינציה, הם המפתח ליצירת מספיק מושבות כדי ללכוד היווצרות טרנסגן תקין. בנוסף, שימוש באנזים תגובת LR הנכון (המופיע בטבלת החומרים) גם משחק תפקיד מרכזי בהצלחת תגובת LR.
מעבר ליצירת מבנה מהונדס וטרנספורמציות חיידקיות, הזרקת העובר ושילוב הגנום יכולים להיות קשים גם כן. הדור של mRNA טרנספוזאז באיכות גבוהה מגדיל מאוד את תדירות האינטגרציה הגנומית10. הנימים שנמשכו צריכים להיעשות זמן קצר לפני הזרקת העוברים, מאחר שמחטים ישנות יותר עלולות לאבד את פעולת הנימים (כלומר, נוזל ההזרקה לא מצליח לעבור לקצה המחט) (איור 3E). גם שבירת קצה המחט כדי להזריק ~ 3 nL של נוזל וגם הזרקת גוף התא דורשים תרגול. פרוטוקול האימון שלנו כולל הזרקת צבע הזרקה אדום פנול לגוף התא בלבד עד לשבירת המחט והזרקת העוברים. הזרקת גוף התא מגדילה באופן דרסטי את קצב קליטת הגנום10. בשילוב כל זה, אנו בממוצע 75% או יותר החדרת גנום וביטוי פסיפס, אבל זה יכול להשתנות ממבנה למבנה.
מכיוון שהחדרה גנומית יכולה להיות אקראית, כל עובר שמראה ביטוי פסיפס הוא החדרה טרנסגנית ייחודית ודורש המשך בדיקה. בדיקה מתמשכת זו נחוצה כדי להראות כי אתר האינטגרציה אינו מזיק להתפתחות העובר, כי מתרחשת העברת קו הנבט, וכי ביטוי הטרנסגן אינו מוחלש או מושתק פוטנציאלית. לאחר שנקבע קו מהונדס, ניתן להשתמש בו בקלות לניתוחים מרובים במחקרי אתנול. עבור מבנים טרנסגניים שאינם פלואורסצנטיים, סמנים טרנסגניים נפוצים כוללים cmlc2:GFP ו- αcrystallin:RFP, המסמנים את הלב והרשתית, בהתאמה, ומאפשרים המשך סינון מהונדס. בנוסף לסמנים טרנסגניים לבדיקה, שני טרנסגנים אלה יכולים לשמש לחקר ישיר של השפעת אתנול על התפתחות הלב והרשתית.
באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, יצרנו קו דגי זברה טרנסגניים sox17:EGFPCAAX שהיה בעל העברה יציבה של קו הנבט של מבנה EGFP ספציפי לאנדודרם המתויג כממברנה. באמצעות קו זה, הצלחנו למדוד את ההשפעה של אתנול על היווצרות כיס אנדודרמלי בעוברים מוטנטיים Bmp רגישים לאתנול. הראינו שהגדלים של שקיות 1-3, אך לא של שקיות 4 ו-5, וגם לא של אורך האנדודרם הכולל, הושפעו במוטציות Bmp שטופלו באתנול (איור 5). עבודת פיילוט זו מצביעה על כך שהאינטראקציה בין Bmp לאתנול משבשת את היווצרות האנדודרם ובמיוחד את התנהגויות התאים העומדות בבסיס היווצרות השקיות. עבודה זו מדגימה את התועלת של יצירת קווי דגי זברה טרנסגניים למחקרי אתנול. כתוצאה מכך, יצירת קווים טרנסגניים חדשים תגביר מאוד את הבנתנו של תהליכים תאיים רגישים לאתנול ואירועי רקמות ב- FASD.
בסופו של דבר, דגי זברה טרנסגניים, ודגי זברה בכלל, הוכיחו את עצמם כחזקים להפליא במחקר של FASD 7,8. ערכת Tol2Kit היא ערכת כלים רב-תכליתית ביותר המאפשרת לחוקרים ליצור במהירות מבנים טרנסגניים מרובים המוכנים להזרקה לדגי זברה. העיצוב המודולרי והקלות של יצירת וקטורי כניסה חדשים מביאים לגמישות קיצונית ביצירת מבנים טרנסגניים ללא צורך לתכנן מחדש רכיבים כלשהם. בסך הכל, ערכת כלים זו תשפר מאוד הן את המחקר של דגי הזברה והן את המחקר בכלל שמטרתו לשפר את ההבנה של FASD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר המוצג במאמר זה נתמך על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי לשימוש לרעה באלכוהול (NIH/NIAAA) R00AA023560 ל- C.B.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawson Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B.
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
- The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
