제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝
Summary
CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.
Abstract
표적 CRISPR-Cas 뉴클레아제 기술의 출현은 기존 모델 시스템과 새로운 모델 시스템 모두에서 정밀한 게놈 편집을 수행하는 능력에 혁명을 일으켰습니다. CRISPR-Cas 게놈 편집 시스템은 합성 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여 CRISPR 관련(Cas) 엔도뉴클레아제를 특정 게놈 DNA 유전자좌에 표적으로 삼으며, 여기서 Cas 엔도뉴클레아제는 이중 가닥 절단을 생성합니다. 본질적으로 오류가 발생하기 쉬운 메커니즘에 의한 이중 가닥 파손의 복구는 삽입 및/또는 삭제로 이어져 궤적을 방해합니다. 대안적으로, 이 공정에 이중 가닥 DNA 공여체 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함시키면 단일 뉴클레오티드 다형성에서 작은 면역학적 태그 또는 큰 형광 단백질 구조에 이르기까지 정확한 게놈 편집을 유도할 수 있습니다. 그러나 이 절차의 주요 병목 현상은 생식계열에서 원하는 편집을 찾아 분리하는 것일 수 있습니다. 이 프로토콜은 Danio rerio (제브라피쉬)의 특정 유전자좌에서 생식계열 돌연변이를 스크리닝하고 분리하기 위한 강력한 방법을 설명합니다. 그러나 이러한 원칙은 생체 내 정자 수집이 가능한 모든 모델에 적용할 수 있습니다.
Introduction
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas 시스템은 Danio rerio(제브라피쉬) 모델 시스템 1,2,3,4에서 유전자좌 특이적 돌연변이 유발 및 정확한 게놈 편집을 수행하는 강력한 도구입니다. Cas-리보핵단백질(RNP)은 Cas 엔도뉴클레아제(일반적으로 Cas9 또는 Cas12a)와 유전자좌 특이적 합성 가이드 RNA(sgRNA)의 두 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다.5. Cas-RNP는 함께 원하는 유전자좌에 이중 가닥 파손(DSB)을 생성하며, 이 절단은 두 가지 고유 복구 메커니즘 중 하나로 복구할 수 있습니다. NHEJ(Non-homologous End Joining) 복구 메커니즘은 오류가 발생하기 쉬우며 종종 DSB 주위에 다양한 삽입 또는 삭제(indels)가 발생합니다. 이러한 indel은 결과 단백질 서열에 프레임시프트 돌연변이 또는 조기 정지를 도입하는 경우 해로울 수 있습니다. 대안적으로, 상동성 지향 복구(HDR) 메커니즘은 손상을 복구하기 위해 DSB 부위를 둘러싸는 상동성 영역을 갖는 기증자 템플릿을 사용한다. 연구원은 HDR 시스템을 활용하여 정확한 게놈 편집을 생성할 수 있습니다. 특히, 그들은 게놈의 DSB 부위 옆에 있는 상동성 영역뿐만 아니라 원하는 편집을 포함하는 이중 가닥 DNA 기증자 구조를 공동 주입할 수 있습니다. 상업적으로 생산된 이러한 CRISPR 구성 요소의 규모 경제가 증가함에 따라 여러 유전자좌를 스크리닝하고 정확한 게놈 편집을 위한 대규모 노력을 설정하는 데 대한 장벽이 크게 감소했습니다. 그러나 유성 생식 동물 모델에서 주요 병목 현상은 생식계열 안정성 돌연변이 동물의 식별 및 분리입니다.
제브라피쉬 모델 시스템은 역 유전 연구에서 사용을 향상시키는 몇 가지 주요 특성을 보여줍니다. 기본적인 수생 주거 장비로 대량으로 쉽게 키울 수 있으며 암컷은 일년 내내 높은 번식력을 보입니다6. 또한, 외부 알을 낳고 수정하면 CRISPR/Cas 구성 요소의 미세 주입이 가능합니다. Cas-RNP는 일반적으로 이론적으로 모든 딸 세포에 의해 유전되는 DSB/복구를 생성하기 위해 1세포 단계 제브라피쉬 배아에 주입됩니다. 그러나 이배체 게놈은 두 상동 염색체를 돌연변이화하기 위해 두 개의 DSB/복구 사건이 필요합니다. 또한, Cas-RNP는 one-cell 단계에서 주입되지만, DSB/복구는 개발 후반 시점까지 발생하지 않을 수 있습니다. 함께, 이러한 요인들은 F0 주입 물고기의 모자이크 특성에 기여합니다. 일반적인 관행은 F0 주입 물고기를 능가하고 F1 자손을 선별하여 인델/특정 편집을 하는 것입니다. 그러나 모든 F0 주입 물고기가 생식계열 돌연변이를 가지고 있는 것은 아니기 때문에 이 관행은 원하는 편집을 생성하지 않는 많은 비생산적인 교배를 초래합니다. F1 체세포가 아닌 F0 생식계열을 스크리닝하면 원하는 생식계열 편집을 분리할 확률이 증가하고 이 과정에 필요한 동물의 수가 줄어듭니다.
안락사 없이 F0 주사 제브라피쉬에서 정자를 쉽게 채취할 수 있습니다. 이 기능은 냉동 정자 스톡의 냉동 보존 및 재유도를 가능하게 하지만7 원하는 게놈 돌연변이8,9의 생식계열 운반체를 신속하게 스크리닝, 식별 및 분리하는 데에도 활용될수 있다. Brocal et al. (2016)은 이전에 F0 주입 수컷 제브라피쉬10에서 생식계열 편집을 스크리닝하기 위한 시퀀싱 기반 방법을 설명했습니다. 생식계열에 존재하는 돌연변이 대립유전자를 식별하는 데 유용하지만 이 접근 방식은 처리량이 높을수록 비용이 많이 들 수 있으며 모든 실험실에서 액세스할 수 있는 것은 아닙니다. 대조적으로, 현재 프로토콜은 생식계열 편집을 식별하기 위한 접근 가능하고 비용 효율적인 전기영동 기반 전략을 제공합니다. 특히, 이 프로토콜은 고분해능 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 특정 유전자좌에서 생식계열 돌연변이를 스크리닝하고 분리하는 강력한 방법을 설명합니다. 또한 이 프로토콜은 특정 편집을 포함하는 기증자 구성의 성공적인 통합을 식별하기 위한 유사한 전략을 설명합니다. 항상 그렇듯이 특정 편집이 필요한 경우 아래에 설명된 프로토콜과 함께 시퀀싱 기반 전략을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 모델 시스템에만 해당되지만 이러한 원칙은 정자 수집이 일상적인 절차인 모든 모델에 적용할 수 있어야 합니다. 함께, 이러한 전략을 통해 표준 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 제한 소화 후 겔에서 해결할 수 있는 생식계열 인델/편집이 있는 F0 주입 수컷을 식별할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 F0 남성 정자 게놈에 대한 집중 분석을 통해 CRISPR-Cas 기술을 사용하여 추정 게놈 편집 또는 표적 돌연변이를 신속하게 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 안락사 없이 정자를 샘플링할 수 있는 다른 동물 모델에 적용할 수 있어야 합니다. 이 방법은 원하는 편집에 대한 스크리닝 처리량을 증가시키며 드문 HDR 매개 knock-in 이벤트를 식별하는 데 특히 유용합니다. 이 접근법…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
핫샷 방법을 사용하여 양질의 정자 게놈 DNA를 얻기 위한 초기 노력에 대해 Washington University School of Medicine의 Anna Hindes에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소 (National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)가 상을 수상했습니다 (R01AR072009에서 RSG).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
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| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
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| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
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