Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra
Summary
As tecnologias CRISPR-Cas revolucionaram o campo da edição do genoma. No entanto, encontrar e isolar a edição de linha germinal desejada continua sendo um grande gargalo. Portanto, este protocolo descreve um método robusto para rastrear rapidamente espermatozoides de peixe-zebra injetados com CRISPR F0 para edições germinativas usando técnicas padrão de PCR, digesto de restrição e eletroforese em gel.
Abstract
O advento de tecnologias nucleases CRISPR-Cas direcionadas revolucionou a capacidade de realizar a edição precisa do genoma em sistemas modelo estabelecidos e emergentes. Os sistemas de edição do genoma CRISPR-Cas usam um RNA guia sintético (sgRNA) para direcionar uma endonuclease associada a CRISPR (Cas) para loci específicos de DNA genômico, onde a endonuclease de Cas gera uma quebra de fita dupla. O reparo de quebras de fita dupla por mecanismos intrínsecos propensos a erros leva a inserções e/ou deleções, interrompendo o locus. Alternativamente, a inclusão de doadores de DNA de fita dupla ou oligonucleotídeos de DNA de fita simples nesse processo pode provocar a inclusão de edições precisas do genoma variando de polimorfismos de nucleotídeo único a pequenas etiquetas imunológicas ou mesmo grandes construções de proteínas fluorescentes. No entanto, um grande gargalo nesse procedimento pode ser encontrar e isolar a edição desejada na linha germinativa. Este protocolo descreve um método robusto para triagem e isolamento de mutações germinativas em loci específicos em Danio rerio (zebrafish); no entanto, esses princípios podem ser adaptáveis em qualquer modelo onde a coleta de espermatozoides in vivo seja possível.
Introduction
O sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas é uma ferramenta poderosa para realizar mutagênese loci-específica e edição precisa do genoma no sistema modelo Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. A Cas-ribonucleoproteína (RNP) é composta por dois componentes principais: uma endonuclease Cas (comumente Cas9 ou Cas12a) e um RNA guia sintético locus-específico (sgRNA)5. Juntos, os Cas-RNP geram uma quebra de fita dupla (DSB) no locus desejado que pode ser reparada por um dos dois mecanismos intrínsecos de reparo. O mecanismo de reparo de junção final não homóloga (NHEJ) é propenso a erros e geralmente resulta em uma variedade de inserções ou exclusões (indels) ao redor do DSB. Esses indéis podem ser deletérios se introduzirem uma mutação frameshift ou parada prematura na sequência de proteínas resultante. Alternativamente, o mecanismo de reparo dirigido por homologia (HDR) usa um modelo de doador com regiões de homologia ao redor do local do DSB para reparar o dano. Os pesquisadores podem aproveitar o sistema HDR para gerar edições genômicas precisas. Especificamente, eles podem co-injetar uma construção de doador de DNA de fita dupla que contém as edições desejadas, bem como regiões de homologia flanqueando o sítio DSB no genoma. O aumento da economia de escala para esses componentes CRISPR produzidos comercialmente reduziu muito as barreiras à triagem de múltiplos loci e ao estabelecimento de esforços em maior escala para a edição precisa do genoma. No entanto, em modelos animais sexualmente reprodutores, um grande gargalo é a identificação e o isolamento de animais mutantes estáveis na linha germinativa.
O sistema modelo zebrafish exibe várias qualidades chave que aumentam seu uso em estudos de genética reversa. Eles são fáceis de criar em grande número com equipamentos básicos de alojamento aquático, e as fêmeas exibem alta fecundidade durante todo o ano6. Além disso, sua postura externa de ovos e fertilização os tornam passíveis de microinjeção de componentes CRISPR/Cas. O CAS-RNP é comumente injetado em embriões de peixe-zebra em estágio unicelular para gerar DSBs/reparo que é, em teoria, herdado por todas as células filhas. No entanto, genomas diploides requerem dois eventos DSB/reparo para mutagenizar ambos os cromossomos homólogos. Além disso, embora o Cas-RNP seja injetado no estágio unicelular, o DSB/reparo pode não ocorrer até pontos posteriores do desenvolvimento. Juntos, esses fatores contribuem para a natureza em mosaico dos peixes injetados com F0. Uma prática comum é cruzar peixes injetados com F0 e selecionar a progênie F1 para indels/edições específicas. No entanto, como nem todos os peixes injetados com F0 possuem mutações germinativas, essa prática resulta em muitos cruzamentos improdutivos que não geram a edição desejada. A triagem da linhagem germinativa F0 em vez do tecido somático F1 aumenta a probabilidade de isolar a linha germinativa desejada e reduz o número de animais necessários nesse processo.
Os espermatozoides podem ser facilmente coletados de peixes-zebra injetados com F0 sem a necessidade de eutanásia. Essa característica permite a criopreservação e a rederivação de espermatozoides congelados7, mas também pode ser explorada para rastrear, identificar e isolar rapidamente os portadores germinativos de mutações genômicas desejadas 8,9. (2016) descreveram anteriormente um método baseado em sequenciamento para triagem de edições germinativas em peixes-zebra machos injetados em F010. Embora útil para identificar os alelos mutados presentes na linha germinativa, essa abordagem pode se tornar dispendiosa em alto rendimento e pode não ser acessível para todos os laboratórios. Em contraste, o protocolo atual oferece uma estratégia baseada em eletroforese acessível e econômica para identificar edições germinativas. Especificamente, este protocolo descreve um método robusto para triagem e isolamento de mutações germinativas em loci específicos usando eletroforese em gel de agarose de alta resolução. Além disso, esse protocolo descreve uma estratégia semelhante para identificar a integração bem-sucedida de um construto doador contendo edições específicas. Como sempre, se edições específicas forem desejadas, estratégias baseadas em sequenciamento podem ser realizadas em conjunto com o protocolo descrito abaixo. Embora este protocolo seja específico para o sistema modelo zebrafish, esses princípios devem ser adaptáveis a qualquer modelo em que a coleta de espermatozoides seja um procedimento de rotina. Juntas, essas estratégias permitirão a identificação de machos injetados com F0 com indels/edições germinativas que podem ser resolvidas em gel após reação em cadeia da polimerase (PCR) padrão e/ou digesto de restrição.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método para caracterizar rapidamente edições do genoma putativo ou mutações direcionadas usando a tecnologia CRISPR-Cas por análise focada em genomas de espermatozoides masculinos F0. Este protocolo deve ser acessível a outros modelos animais em que os espermatozoides estejam prontamente disponíveis para amostragem sem eutanásia. Esse método aumentará a taxa de transferência de triagem para edições desejadas e é especialmente útil para identificar eventos raros mediados por HDR….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Anna Hindes, da Escola de Medicina da Universidade de Washington, por seus esforços iniciais na obtenção de DNA genômico de espermatozoides de boa qualidade usando o método hot shot. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob Prêmio (R01AR072009 a R.S.G.).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
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| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
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| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
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| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
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| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
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| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
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