Screening spermier för snabb isolering av germline redigeringar i zebrafisk

Summary

CRISPR-Cas-teknologier har revolutionerat området genomredigering. Att hitta och isolera den önskade könsredigeringen är dock fortfarande en stor flaskhals. Därför beskriver detta protokoll en robust metod för att snabbt screena F0 CRISPR-injicerade zebrafiskspermier för könsredigeringar med hjälp av standard PCR, restriktionssmälta och gelelektroforestekniker.

Abstract

Tillkomsten av riktade CRISPR-Cas-nukleasteknologier har revolutionerat förmågan att utföra exakt genomredigering i både etablerade och framväxande modellsystem. CRISPR-Cas genomredigeringssystem använder ett syntetiskt guide-RNA (sgRNA) för att rikta ett CRISPR-associerat (Cas) endonukleas till specifika genomiska DNA-loci, där Cas-endonukleas genererar en dubbelsträngbrytning. Reparation av dubbelsträngade brott genom inneboende felbenägna mekanismer leder till infogningar och / eller borttagningar, vilket stör platsen. Alternativt kan införandet av dubbelsträngade DNA-donatorer eller enkelsträngade DNA-oligonukleotider i denna process framkalla införandet av exakta genomredigeringar som sträcker sig från enkla nukleotidpolymorfismer till små immunologiska taggar eller till och med stora fluorescerande proteinkonstruktioner. En stor flaskhals i denna procedur kan dock vara att hitta och isolera önskad redigering i könslinjen. Detta protokoll beskriver en robust metod för screening och isolering av germlinemutationer vid specifika loci i Danio rerio (zebrafisk); Dessa principer kan dock vara anpassningsbara i alla modeller där spermainsamling in vivo är möjlig.

Introduction

CRISPR-systemet (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas är ett kraftfullt verktyg för att utföra loci-specifik mutagenes och exakt genomredigering i Danio rerio (zebrafisk) modellsystem 1,2,3,4. Cas-ribonukleoproteinet (RNP) består av två huvudkomponenter: ett Cas-endonukleas (vanligtvis Cas9 eller Cas12a) och ett lokusspecifikt syntetiskt guide-RNA (sgRNA)⁵. Tillsammans genererar Cas-RNP ett dubbelsträngat brott (DSB) i önskad plats som kan repareras med en av två inneboende reparationsmekanismer. Den icke-homologa ändfogningsmekanismen (NHEJ) är felbenägen och resulterar ofta i en mängd olika infogningar eller borttagningar (indels) runt DSB. Dessa indels kan vara skadliga om de introducerar en frameshift-mutation eller för tidigt stopp i den resulterande proteinsekvensen. Alternativt använder den homologiriktade reparationsmekanismen (HDR) en givarmall med homologiregioner som omger DSB-webbplatsen för att reparera skadan. Forskare kan dra nytta av HDR-systemet för att generera exakta genomiska redigeringar. Specifikt kan de saminjicera en dubbelsträngad DNA-donatorkonstruktion som innehåller de önskade redigeringarna såväl som homologiregioner som flankerar DSB-platsen i genomet. Den ökade stordriftsekonomin för dessa kommersiellt producerade CRISPR-komponenter har kraftigt minskat hindren för screening av flera loci och för att inrätta storskaliga insatser för exakt genomredigering. Men i sexuellt reproducerande djurmodeller är en stor flaskhals identifieringen och isoleringen av germline-stabila mutanta djur.

Zebrafiskmodellsystemet uppvisar flera viktiga egenskaper som förbättrar dess användning i omvända genetiska studier. De är lätta att föda upp i stort antal med grundläggande vattenlevande husutrustning, och honor uppvisar hög fecundity året runt⁶. Dessutom gör deras yttre äggläggning och befruktning dem mottagliga för mikroinjektion av CRISPR / Cas-komponenter. Cas-RNP injiceras vanligen i zebrafiskembryon i encellsstadium för att generera DSB/reparation som i teorin ärvs av alla dotterceller. Diploida genom kräver dock två DSB/reparationshändelser för att mutagenisera båda homologa kromosomerna. Dessutom, även om Cas-RNP injiceras i encellsstadiet, kan DSB/reparation inte ske förrän senare i utvecklingen. Tillsammans bidrar dessa faktorer till mosaikens natur hos F0-injicerad fisk. En vanlig praxis är att korsa F0-injicerad fisk och screena F1-avkomman för indels/specifika redigeringar. Men eftersom inte alla F0-injicerade fiskar har könsmutationer, resulterar denna praxis i många improduktiva korsningar som inte genererar önskad redigering. Screening av F0-könslinjen snarare än F1-somatisk vävnad ökar sannolikheten för att isolera den önskade könscellredigeringen och minskar antalet djur som krävs i denna process.

Spermier kan enkelt samlas in från F0-injicerade zebrafiskar utan behov av eutanasi. Denna funktion möjliggör kryokonservering och rederivation av frysta spermiestammar⁷ men kan också utnyttjas för att snabbt screena, identifiera och isolera könscellsbärarna av önskade genomiska mutationer ^8,9. Brocal et al. (2016) beskrev tidigare en sekvenseringsbaserad metod för screening av könslinjeredigeringar i F0-injicerade manliga zebrafiskar¹⁰. Även om det är användbart för att identifiera de muterade allelerna som finns i könslinjen, kan detta tillvägagångssätt bli kostsamt vid hög genomströmning och kanske inte är tillgängligt för alla laboratorier. Däremot erbjuder det nuvarande protokollet en lättillgänglig och kostnadseffektiv elektroforesbaserad strategi för att identifiera könsredigeringar. Specifikt beskriver detta protokoll en robust metod för screening och isolering av germlinemutationer vid specifika loci med hjälp av högupplöst agarosgelelektrofores. Dessutom beskriver detta protokoll en liknande strategi för att identifiera framgångsrik integration av en givarkonstruktion som innehåller specifika redigeringar. Som alltid, om specifika redigeringar önskas, kan sekvenseringsbaserade strategier utföras tillsammans med protokollet som beskrivs nedan. Även om detta protokoll är specifikt för zebrafiskmodellsystemet, bör dessa principer kunna anpassas till alla modeller där insamling av spermier är ett rutinförfarande. Tillsammans kommer dessa strategier att möjliggöra identifiering av F0-injicerade hanar med germline indels/redigeringar som kan lösas på en gel efter standard polymeraskedjereaktion (PCR) och/eller restriktionssmältning.

Protocol

Denna studie genomfördes i enlighet med riktlinjerna i Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Institutes of Health. Protokollet godkändes av University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee (AUP-2021-00254). 1. Designa sgRNA för CRISPR-mutagenes Hämta exonsekvensen som innehåller målplatsen. Designa ett syntetiskt guide-RNA (sgRNA) med ett protospacer intilliggande motiv (PAM) -ställe som är specifikt för Cas-end…

Representative Results

De experimentella tillvägagångssätten som beskrivs i detta protokoll möjliggör snabbare identifiering av genomredigeringar eller förmodade skadliga alleler genom att fokusera på analys av tusentals genom som härrör från insamling av F0-injicerade manliga spermier. Figur 2 belyser hur man tolkar de resultat som erhållits med hjälp av detta protokoll. För att generera mutationer i p2ry12-lokus injicerades zebrafiskembryon i encellsstadium med Cas9-endon…

Discussion

Detta protokoll beskriver en metod för att snabbt karakterisera förmodade genomredigeringar eller riktade mutationer med hjälp av CRISPR-Cas-teknik genom fokuserad analys på F0 manliga spermiegenom. Detta protokoll bör vara mottagligt för andra djurmodeller där spermier är lätt tillgängliga för provtagning utan avlivning. Den här metoden ökar genomströmningen för screening av önskade redigeringar och är särskilt användbar för att identifiera sällsynta HDR-medierade dominoningshändelser. Detta tillv?…

Materials

Agarose powder	Fisher BioReagents	BP1356-100
Breeding tanks	Carolina Biological	161937
BstNI Restriction Enzyme	NEB	R0168S
Cas9 Endonuclease	IDT	1081060
DNA Ladder, 100 bp	Thermo Scientific	FERSM0241
dnah10 donor construct	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 forward primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')
dnah10 reverse primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')
dnah10 synthetic sgRNA	Synthego	Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'
Electrophoresis power supply	Thermo Scientific	105ECA-115
Filter forceps	Millipore	XX6200006P
Fish (system) water	Generic	n/a
Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber)	Thermo Scientific	B2
Gel imaging light box	Azure Biosystems	AZI200-01
Gel stain, 10000X	Invitrogen	S33102
Glass bowl, 250 mL	Generic	n/a
Isolation tanks, 0.8 L	Aquaneering	ZT080
Microcap capillary tube with bulb, 20 µL	Drummond	1-000-0020/CA
Minicentrifuge	Bio-Rad	12011919EDU
Micropipettes, various with appropriate tips	Generic	n/a
Microwave	Generic	n/a
Nuclease free water	Promega	P119-C
Paper towels	Generic	n/a
PCR tubes, 0.2 mL	Bioexpress	T-3196-1
Plastic spoon, with drilled holes/slots	Generic	n/a
KCl solution, 0.2 M RNAse Free	Sigma-Aldrich	P9333
p2ry12 forward primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')
p2ry12 reverse primer	Sigma-Aldrich	DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')
p2ry12 synthetic sgRNA	Synthego	Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
Restriction Enzyme 10X Buffer	NEB	B6003SVIAL
NaOH solution, 50 mM	Thermo Scientific	S318; 424330010
Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot	Generic	n/a
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 508
Taq polymerase master mix, 2X	Promega	M7122
TBE Buffer Concentrate, 10X	VWR	E442
Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
Tissue paper	Fisher Scientific	06-666
Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2)	Syndel	200-266
Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0)	Promega	H5131