פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה וההרצה של מערכת מיקרו-רספירומטריה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את התכונות הפיזיולוגיות של הולוביונט האלמוגים.
פעילות מטבולית, המוגדרת כסכום התהליכים האורגניזמים המערבים אנרגיה, היא בעלת חשיבות מכרעת בהבנת תפקודם והתפתחותם של החיים על פני כדור הארץ. מדידת קצב חילוף החומרים של אורגניזמים עומדת אפוא במרכז הסבר המצבים הפיזיולוגיים של אורגניזמים, תפקידיהם האקולוגיים והשפעת השינויים הסביבתיים על מינים במערכות אקולוגיות יבשתיות ומיימיות. בשוניות אלמוגים נעשה שימוש במדדי חילוף חומרים כדי לכמת את תפקוד הסימביוזה בין אלמוגים לבין סימביוטות האצות המחייבות שלהם (Symbiodiniaceae), וכן להעריך כיצד גורמי עקה סביבתיים, כולל שינויי אקלים, ישפיעו על בריאות האלמוגים. למרות משמעות זו, חסרות שיטות, ולכן נתונים, הנוגעים למדידות קצב חילוף החומרים בצאצאי אלמוגים, ככל הנראה בשל גודלם הקטן. כדי להתמודד עם פער זה, מחקר זה נועד לפתח מערך מותאם אישית למדידת הנשימה של אקולוגיות קטנות (טווח גודל מילימטרי) של בעלי חיים ימיים. עלות נמוכה זו והתקנה קלה זו אמורה לאפשר מדידה משופרת של קצב חילוף החומרים. זה יהיה חיוני למחקר אקולוגי יישומי המשתמש בייצור מיני של אלמוגים לשיקום שוניות.
נשימה היא מדידה ביולוגית קריטית המסמנת את הפעילות המטבולית הכוללת של אורגניזם, אך כמו תכונות קריטיות אחרות (גדילה), קשה למדוד אותה באורגניזמים קטנים1. נשימה יכולה להיות מוגדרת כחמצון של מולקולות אורגניות באמצעות שימוש בחמצן. תהליך זה מייצר את האנרגיה הכימית הדרושה לתפקוד התא (כלומר, חילוף חומרים), החיונית להישרדותם של אורגניזמים. לחלופין, חילוף חומרים אנאירובי גורם לחוב חמצן2. ניתן לקבוע את קצב הנשימה באמצעות אופטודות המודדות את השימוש (ולכן את הירידה) בריכוז החמצן לאורך זמן בתא סגור, נוהג הידוע בדרך כלל בשם רספירומטריה3. בהתחשב בכך שרוב האורגניזמים אינם מאחסנים חמצן, ניתן להסיק את קצב חילוף החומרים באמצעות הקשר הישיר בין נשימה לשימוש בפחמן. מסיבה זו, ניתן להמיר את קצב הנשימה לשימוש יומיומי בפחמן, אשר מודיע על תפקודים מטבוליים קריטיים כמו גדילה, רבייה והיכולת לשמור על הומאוסטזיס מטבולי בתקופות של לחץ סביבתי 4,5, כולל תנאי גלי חום שבדרך כלל מובילים לעקה או להלבנה באלמוגים.
שוניות האלמוגים יורדות בעולם בקצב מואץ. חיית האלמוגים מאכלסת קונסורציום של שותפים (כולל dinoflagellate Symbiodiniaceae, פטריות, חיידקים ווירוסים), המכונים ביחד “holobiont”6. ככל שטמפרטורת האוקיינוס עולה, אלמוגים, ולכן שוניות אלמוגים, נמצאים תחת לחץ גובר לשרוד, שכן טמפרטורות גבוהות מובילות לאובדן של ה-dinoflagellate Symbiodiniaceae (להלן סימביוטים), תופעה הידועה בשם הלבנה7. חומרי מזון רבים אינם זמינים לאלמוגים במים טרופיים אוליגוטרופיים, כולל חנקן אנאורגני וזרחן8. כדי להתמודד, אלמוגים יוצרים סימביוזה תזונתית מחייבת עם הסימביונטים של דינופלגלאט (Symbiodiniaceae), המספקים את רוב חומרי המזון הדרושים למארח האלמוגים כדי לשרוד ולהפקיד את שלדי הסידן הפחמתי שלהם9. סימביוזה מתפקדת עשויה להתאפיין ברמות גבוהות של חלוקת פחמן בין בני זוג10,11, והסדרת הסימביוזה כרוכה בהומאוסטזיס דינמי12.
במהלך עקת חום, הוויסות הדינמי והתקשורת משתבשים, וכתוצאה מכך דיסביוזה והלבנה (נסקר בהתייחסות13). מדידות מטבוליות, כגון פוטוסינתזה ונשימה, טומנות בחובן פוטנציאל להבהיר הן את המצב הדיסביוטי הבריא והן את המצב הדיסביוטי הבלתי מווסת של אלמוגים, ומדידה מדויקת של תהליכים אלה על פני אונטוגניות היא קריטית להבנת תפקוד האורגניזם. זה חשוב במיוחד ככל שהתדירות והעוצמה של אירועי הלבנה המוניים גדלים, עם פוטנציאל להשפיע על שינויים בשיתוף חומרי מזון מהסימביוטים, שם נמצא כי העברת הפחמן יורדת ככל שהטמפרטורות עולות14. זה יכול לנבוע ממנגנונים מכוונים על ידי חומרי המזון הסימביוטיים או מפשרות פיזיולוגיות קשות (סבילות תרמית מוגברת אך ירידה בהישרדות הפונדקאי 15,16,17). שיבושים בסימביוזה עשויים לנבוע הן מהסימביונט והן מהפונדקאי, אם כי גורם מוביל הוא ככל הנראה התקלה התאית של סימביונט18. עם זאת, מתח הנגרם על ידי עלייה בטמפרטורות מי הים מערער את הסימביוזה הזו; חלוקת הפחמן מסימביונט לפונדקאי מצטמצמתב-19,20, ורעב של האלמוגים עלול להיווצר. זה עשוי לבוא לידי ביטוי בירידה במאגרי שומנים ופחמימות באלמוגים עקב שימוש מוגבר בפונדקאי (“קטבוליזם מוגבר של פחמן קבוע”), ככל הנראה עקב שיתוף מופחת על ידי סימביוטים11. לצד תרומת הפוטוסינתזה והנשימה של הסימביונטים של האלמוגים, נשימת חיית האלמוגים היא מדד חשוב להבנת בריאות האלמוגים, השפעות ההלבנה וחילופי החומרים המזינים בין בני זוג אלה, וצמיחת ההולוביונט, פנוטיפ הרלוונטי להישרדות שינוי סביבתי 8,21,22. לבסוף, בהתחשב בכך שאלמוגים רבים הם סימביוטיים, השימוש ברספירומטריה כדי לאפיין פוטוסינתזה בנוסף לנשימה שימושי במיוחד להקשר יחסי P:R ולהבנה אם הסימביוזה יציבה או לא (למשל, הפניה23).
שינויים סביבתיים, אם כן, גורמים לשינויים בתקציבי האנרגיה של האלמוג והסימביוטים שלו, מה שמוביל להבדלים בצמיחה14. כדי להתמודד, פונדקאי האלמוגים עשוי להגביר את הנשימה ואת השימוש בשומנים כדי לענות על הדרישות המטבוליות שלו; לחץ חום יכול להפחית את התפוקה נטו ב -60% עקב נשימה מוגברת זו14, כפי שנמדד על ידי שינוי בחמצן מומס. Symbiodiniaceae עשוי גם להגביר את הטמעת החנקן ואת שימור הפחמן14,24, ולאחר מכן להשתמש במאגרים אלה כדי להעביר אנרגיה לעבר מנגנוני התיקון וההגנה שלהם25,26. האיזון של N ו-C חשוב לוויסות הצמיחה, ו-P בפרט27, מה שעשוי להתבטא בוויסות דינמי של שפע סימביונטי. ואכן, עדויות שנאספו מאלמוגים על פני מרחבי שוניות גדולות (>1,000 ק”מ) מצביעות על כך שלפונדקאים יש את היכולת להגביל את הצמיחה הסימביונטית באמצעות ויסות זרחן, אם כי זה משתנה לפי מיני אלמוגים27.
יחד, מחקרים אלה מצביעים על עלייה של סובלנות לחום עם ירידה במקביל בייצור או טרנסלוקציה של חומרים מזינים (כלומר, הנטייה לסימביוזה) עקב שינויים סביבתיים. לפיכך, יש להשתמש בשיטות חד-נעורים רבות-עוצמה, כגון כימות השימוש בחמצן באמצעות מיקרו-רספירומטריה, כדי להבין את המנגנונים הבסיסיים הקשורים לחילוף חומרים, ולאחר מכן ליישם אותן בשאלות שימור כגון הבנת רכישת סבילות לחום. זה מוצג כאן ככלי מיקרו-רספירומטריה למדדים פיזיולוגיים, שנועד לחקור את הקשר התזונתי בין אלמוגים צעירים לסימביונטות האצות שלהם, אך מתאים לאורגניזמים ימיים קטנים אחרים.
ניתן למדוד את השימוש או הייצור של חמצן על ידי אורגניזמים על ידי הצבתו בתאי ספירומטריה בודדים אטומים הרמטית או “רספירומטרים” (להלן תאים), שבהם שינוי החמצן נמדד באמצעות אופטודות3. אופטודות הן גשושיות המודדות את ריכוז החמצן באמצעות פולסי אור, ורישום מדידות לאורך זמן מאפשר חישוב קצב נשימה ו/או פוטוסינתזה. בפועל, מדידת נשימה דומה למדידת פוטוסינתזה באלמוגים, אלא שהאלמוגים מודגרים בחושך מוחלט. הפחתת סך הנשימה היומית של האלמוגים והסימביוטים מסך הפוטוסינתזה היומית מביאה להפרש חמצן (דלתא חמצן)2,3. באופן כללי, אורגניזמים משתמשים ביותר חמצן ממה שהם מייצרים, וכתוצאה מכך נוצר גירעון. זה יכול להיות מומר שווה ערך פחמן מאז חמצן ופחמן נצרכים ביחס קבוע2. עודפי הפחמן יכולים לשמש את האלמוגים לצמיחה, סינתזת ריר ורבייה, וצרכים מטבוליים חיוניים אחרים12.
פרוטוקול זה מתאר שיטת מיקרו-נשימה (איור 1) ששימשה למדידת קצבי נשימה (R) עבור אלמוגים צעירים בודדים באמצעות עיצוב תא זכוכית מותאם אישית של 1.5 מ”ל (בקבוקון עם חוט GL25 וגובה 20 מ”מ, עם בליטה/רכס, שפת קרקע שטוחה ומכסה בורג עם חור; ראו טבלת חומרים) מלא במי ים מסוננים של 0.5 מיקרומטר. אופטודות סיבים אופטיים (ראו טבלת חומרים) הוכנסו לכל תא דרך חור בצד המכסה. כל אלמוג בודד היה מחובר מעל רשת קשה, פלטפורמת צלחת ערבוב זורם מעל מוט ערבוב מגנטי כדי להבטיח ערבוב נאות של מים בתוך התא. בדוגמה המייצגת כאן, שני פקדים או “ריקים” (תאים שהיו זהים למעט נוכחות הדגימה) נמדדו במקביל לשלושת תאי הדגימה המשוכפלים, מכיוון שהיו לנו מספר בקרים שפעלו בו זמנית. עם זאת, דוגמת ההגדרה (איור 2) מציגה רק את השימוש בארבעה ערוצים; ניתן להגדיל זאת באמצעות בקרים מרובים ועמדות זרימה מרובות. ניתן לשלוט בטמפרטורה גם במערכת זו על ידי טבילת כל תא באמבט מים מותאם אישית עם טמפרטורות מים קבועות מראש (27 ° C לשליטה או 31 ° C ללחץ הטמפרטורה הגבוה בנתונים לדוגמה כאן) באמצעות מערכת זרימה מחזורית (זרימה רציפה ועדינה שנקבעה על 75 L / h). פלטפורמת צלחת הבוחש וצלחת הבוחש עם גלגלי השיניים יכולות להיות בכל גודל וניתן להכין אותן גדולות או קטנות ככל שנדרש כדי להכיל את מספר תאי הזכוכית. בדוגמה זו, המשטח והצלחת היו בערך 34 ס”מ x 26 ס”מ x 3 ס”מ (טבלה של חומרים). כיול האופטודות בוצע לפני כל ריצה באמצעות שתי תמיסות סטנדרטיות המייצגות ריווי חמצן של 0% ו-100% בטמפרטורת המים והמליחות המתאימה לסביבת ניסוי זו.
עבודה זו מתארת את הבנייה של מערך מיקרו-רספירומטריה מותאם אישית שניתן להשתמש בו כדי לכמת את כמות החמצן הנצרכת ומיוצרת על ידי אורגניזמים ימיים קטנים sessile. המרכיבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים את הגדרת החדרים, כולל הכתמים, וכיול האות הנמוך באמצעות חבילת respR , שבה אות נמוך יכול להיות מוגדר כשיעורים המאופיינים במדרונות רדודים או רועשים. התא המותאם אישית וההתקנה שלו מאפשרים זיהוי של אותות נמוכים אפילו, בעוד השימוש בחבילת R מסייע בהגנה מפני בעיות שבהן התרחשות של מדרונות רדודים או רועשים עלולה להוביל לפרשנות שגויה של התוצאות (למשל, תוצאות חיוביות שגויות).
שינויים פוטנציאליים שיידרשו עבור משתמשים אחרים כוללים את אבטחת האורגניזם של עניין בתוך החדר בהתאמה אישית. במקרה זה, נעשה שימוש באזיקון קטן ונוקשה ובדבק אקווריום כדי לאבטח את הנער הבודד לבסיס הפלסטיק, שהודבק לאחר מכן לעניבה. יש לציין כי לצורך ניסוי זה, צעירי אלמוגים התיישבו על יריעות פלסטיק שחורות. פלסטיק זה איפשר הסרה קלה של צעירי האלמוגים, שהחליקו למעשה מהפלסטיק, כדי לא לפגוע בהם פיזית במהלך ההסרה. צעירי האלמוגים נצמדים למצע עליו הם מתיישבים, ולכן מומלץ ליישב אותם על חומר פלסטי דומה, באמצעות פפטיד מלאכותי16 כדי להקל על הסרתם לצורך תהליך ההדבקה. כדי למזער עוד יותר את הטיפול בעקה ואת ההשפעה על תגובת הנשימה, מומלץ לאפשר לאלמוגים המורכבים על אזיקוני רוכסן להתאקלם במשך שבוע-שבועיים, כפי שמקובל בניסויי עקה רבים של אלמוגים בוגרים. ייתכן שיהיה צורך בשינויים אחרים כדי לאבטח את האורגניזם מעל המקום במכסה ולאפשר זרימת מים. שלב מפתח נוסף לפתרון בעיות כרוך בזיהוי אותות, במיוחד בשיפוע של סדרת הזמן של החמצן שבו יש לקבוע שיעורים. בסופו של דבר, זה מסתכם בשילוב של הפעלת שיקול דעת כדי לא לכלול נתונים בלתי יציבים בעליל, ואת הפונקציות בתוך respR כדי לאפשר שיעורי חילוץ מאזורים שנבחרו באופן עקבי או באופן אוטומטי על ידי זיהוי אזורים ליניאריים של הנתונים. דוגמאות נוספות כיצד לעשות זאת זמינות באתר האינטרנט של respR .
שיטה זו פותחה כדי להרחיב את המדידות של הגבול התחתון של הנשימה לחסרי חוליות ימיים קטנים מאוד. המגבלה הברורה היא שפרוטוקול זה עשוי להיות מועד יותר לתוצאות חיוביות שגויות בהשוואה לפרוטוקולים המיועדים לביומסה גדולה יותר. עם זאת, בהתחשב בכך שזו הייתה מטרת התכנון – למדוד את הגבולות התחתונים הללו – זה נלקח בחשבון בעיצוב, וניתן להשתמש בהליך עם חבילת respR כדי להגן טוב יותר מפני תוצאות חיוביות שגויות. חשוב גם להכיר בכך שקיימות מערכות אחרות למדידת נשימה30, ולמדידת אורגניזמים קטנים, כולל רספירומטריה על קופפודים בודדים31 בנפחים קטנים יותר מזה (~0.5-1 מ”ל), אך הן יקרות או חסרות רכיבים ספציפיים (יכולת ערבוב). עם זאת, מערכת זו היא קוד פתוח ובעלות נמוכה יחסית בהשוואה למערכות מסחריות (למשל, מערכת Core Microplate). מערכת זו משלבת גם שיקולים מתודולוגיים מרכזיים כמו ערבוב, שמערכות אחרות עשויות להיות חסרות. תכונת מוט הערבוב הפנימי חיונית כדי לשכפל את ערבוב המים הטבעי של אורגניזמים ימיים רבים (למשל, קופפודים באמצעות שחייה), שלעתים קרובות אינו אפשרי ועלול להפוך את הנתונים לבלתי שמישים במידה רבה. לעומת זאת, שיטות ערבוב אחרות הזמינות כוללות הנחת כל הרספירומטר על ספסל נדנדה ענק, הדורש ציוד נוסף ויש לו הצלחה מוגבלת בערבוב, או ערבוב באמצעות רטט, אשר יכול לגרום הפרעה לאורגניזם. מסיבה זו, זוהי המערכת היחידה שיכולה לבצע רספירומטריה על אלמוגים צעירים או אורגניזמים קטנים מאוד אחרים. לשם השוואה, טווח הגודל של הדגימות שנכללו כאן נע בין 2.1 ל -3.6 פוליפים (המקבילים לגיל חודשים ספורים בלבד), עם שטח ממוצע מינימלי עד מקסימלי של 1.3 עד 4.5 מ”מ2.
רספירומטריה היא מדד בסיסי במחקרים אקולוגיים, וקיימות שיטות רבות למטרה זו. עם זאת, רוב השיטות הקיימות הללו מכוונות לדגימות ביומסה גבוהות, כולל דגים שלמים, שברי אלמוגים או עשבי ים 32,33,34. שיטה זו היא הראשונה שהשתמשה בצעירי אלמוגים בודדים. בנוסף, ישנם יישומים פוטנציאליים רבים עבור שיטה זו, שכן הוא מספק מידע פיזיולוגי מרכזי על תפקוד האורגניזם. זה יכול להיות חשוב עבור מחקרים המעוניינים לאפיין הערכות בריאות בסיסיות35, להבין את התפקיד של לחץ אקוטי או ארוך טווח במהלך אונטוגניות אלמוגים כגון עקת חום36, או לספק ערכי סף שמנהלים יכולים להגדיר כדי לעזור להגן ולשפר את הבריאות של שוניות אלמוגים37. בהתחשב בכך שהאלמוג הוא הולוביונט וקהילת הסימביונט גמישה יחסית בשלב זה ולאורך השנה הראשונה לחיים38, יהיה מעניין לשדך נתוני ספירומטריה עם שינויים בקהילות לאורך זמן, כדי להקשר באופן מלא את תפקוד האורגניזם בכללותו. חשוב לציין, שיטה זו תורמת לטכניקות “מדע פתוח” המסייעות לספק מתווה ליצירת מערכי ניסוי מותאמים אישית שניתן לשתף, לשפר ולתקנן באופן פתוח.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לסם נונן על עזרתו ועצתו, לסוון אוטיק על השימוש בתאי הרספירומטריה הראשוניים, לבן שלאב על האיור ההנדסי שלו, ולסדנת המכון האוסטרלי למדעי הים לעיבוד שבבי בהתאמה אישית של מתאמים ומחזיקי תאי ספירומטריה. האלמוגים נאספו תחת היתר הפארק הימי שונית המחסום הגדולה הבא ל- AIMS G12/ 35236.1. אלמוגים אינם זקוקים להיתרי אתיקה.
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |