Questo protocollo descrive la messa a punto e il funzionamento di un sistema di micro-respirometria che può essere impiegato per studiare le caratteristiche fisiologiche dell’olobionte corallo.
L’attività metabolica, definita come la somma dei processi dell’organismo che coinvolgono l’energia, è di fondamentale importanza per comprendere la funzione e l’evoluzione della vita sulla terra. La misurazione dei tassi metabolici degli organismi è, quindi, al centro della spiegazione degli stati fisiologici degli organismi, dei loro ruoli ecologici e dell’impatto dei cambiamenti ambientali sulle specie all’interno degli ecosistemi terrestri e acquatici. Sulle barriere coralline, le misure del metabolismo sono state utilizzate per quantificare il funzionamento della simbiosi tra i coralli e i loro simbionti algali obbligati (Symbiodiniaceae), nonché per valutare in che modo i fattori di stress ambientale, compresi i cambiamenti climatici, avranno un impatto sulla salute dei coralli. Nonostante questa importanza, mancano metodi, e quindi dati, relativi alle misurazioni del tasso metabolico nella prole dei coralli, probabilmente a causa delle loro piccole dimensioni. Per colmare questa lacuna, questo studio mirava a sviluppare una configurazione personalizzata per misurare la respirazione di piccole ecologie di animali marini (gamma di dimensioni millimetriche). Questo basso costo e la facile configurazione dovrebbero consentire una migliore misurazione del tasso metabolico. Questo sarà essenziale per la ricerca ecologica applicata che utilizza la produzione sessuale di coralli per il ripristino della barriera corallina.
La respirazione è una misura biologica critica che segnala l’attività metabolica complessiva di un organismo, ma come altri tratti critici (crescita), è difficile da misurare nei piccoli organismi1. La respirazione può essere definita come l’ossidazione di molecole organiche attraverso l’utilizzo dell’ossigeno. Questo processo genera l’energia chimica necessaria per la funzione cellulare (cioè il metabolismo), che è essenziale per la sopravvivenza degli organismi. In alternativa, il metabolismo anaerobico provoca un debito di ossigeno2. Le frequenze respiratorie possono essere determinate utilizzando optodi che misurano l’utilizzo (e quindi la diminuzione) della concentrazione di ossigeno nel tempo in una camera chiusa, una pratica generalmente nota come respirometria3. Dato che la maggior parte degli organismi non immagazzina ossigeno, il tasso di metabolismo può essere dedotto attraverso la correlazione diretta tra la respirazione e l’utilizzo del carbonio. Per questo motivo, i tassi di respirazione possono essere convertiti in consumo giornaliero di carbonio, che informa le funzioni metaboliche critiche come la crescita, la riproduzione e la capacità di mantenere l’omeostasi metabolica durante i periodi di stress ambientale 4,5, comprese le condizioni di ondata di calore che generalmente portano a stress o sbiancamento nei coralli.
Le barriere coralline stanno diminuendo a livello globale a un ritmo accelerato. L’animale corallo ospita un consorzio di partner (tra cui dinoflagellati Symbiodiniaceae, funghi, batteri e virus), collettivamente denominati “olobionte”6. Con l’aumento delle temperature oceaniche, i coralli, e quindi le barriere coralline, sono sottoposti a una crescente pressione per sopravvivere, poiché le alte temperature portano alla perdita delle dinoflagellate Symbiodiniaceae (di seguito simbionti), un fenomeno noto come sbiancamento7. Molti nutrienti non sono altrimenti disponibili per i coralli nelle acque tropicali oligotrofiche, tra cui l’azoto inorganico e il fosforo8. Per far fronte a questa situazione, i coralli formano una simbiosi nutrizionale obbligata con i loro simbionti dinoflagellati (Symbiodiniaceae), che forniscono la maggior parte dei nutrienti necessari al corallo ospite per sopravvivere e depositare i loro scheletri di carbonato di calcio9. Una simbiosi funzionante può essere caratterizzata da alti livelli di condivisione del carbonio tra i partner 10,11 e la regolazione della simbiosi comporta un’omeostasi dinamica12.
Durante lo stress da calore, questa regolazione dinamica e la comunicazione vengono interrotte, con conseguente disbiosi e sbiancamento (esaminato nel riferimento13). Le misurazioni metaboliche, come la fotosintesi e la respirazione, hanno quindi il potenziale per chiarire sia gli stati sani che quelli disbiotici non regolati dei coralli, e misurare con precisione questi processi attraverso l’ontogenesi è fondamentale per comprendere il funzionamento dell’organismo. Ciò è particolarmente importante con l’aumento della frequenza e dell’entità degli eventi di sbiancamento di massa, con il potenziale di influenzare i cambiamenti nella condivisione dei nutrienti da parte dei simbionti, dove è stato riscontrato che il trasferimento di carbonio diminuisce con l’aumento delle temperature14. Ciò potrebbe essere dovuto a meccanismi diretti dal simbionte che sequestra i nutrienti o da compromessi fisiologici (aumento della tolleranza termica ma diminuzione della sopravvivenza dell’ospite 15,16,17). Le interruzioni della simbiosi possono derivare sia dal simbionte che dall’ospite, anche se un fattore principale è probabilmente il malfunzionamento cellulare del simbionte18. Tuttavia, lo stress causato dall’aumento delle temperature dell’acqua di mare destabilizza questa simbiosi; La condivisione del carbonio dal simbionte all’ospite è diminuita19,20 e può verificarsi la fame del corallo. Ciò può riflettersi in una diminuzione delle riserve di lipidi e carboidrati nei coralli a causa dell’aumento dell’uso dell’ospite (“aumento del catabolismo del carbonio fisso”), probabilmente a causa della diminuita condivisione da parte dei simbionti11. Oltre al contributo della fotosintesi e della respirazione dei simbionti dei coralli, la respirazione dell’animale corallo è una misura importante per comprendere la salute dei coralli, gli impatti dello sbiancamento e dello scambio di nutrienti tra questi partner e la crescita dell’olobionte, un fenotipo rilevante per sopravvivere ai cambiamenti ambientali 8,21,22. Infine, dato che molti coralli sono simbiotici, l’uso della respirometria per caratterizzare la fotosintesi oltre alla respirazione è particolarmente utile per contestualizzare i rapporti P:R e capire se la simbiosi è stabile o meno (ad esempio, riferimento23).
I cambiamenti ambientali, quindi, causano cambiamenti nei bilanci energetici del corallo e dei suoi simbionti, portando a differenze nella crescita14. Per far fronte a questa situazione, l’ospite corallo può aumentare la respirazione e l’utilizzo dei lipidi per soddisfare le sue richieste metaboliche; Lo stress da calore può ridurre la produttività netta del 60% a causa di questo aumento della respirazione14, misurato da una variazione dell’ossigeno disciolto. Le Symbiodiniaceae possono anche aumentare l’assimilazione dell’azoto e la ritenzione di carbonio14,24, e quindi utilizzare queste riserve per spostare l’energia verso i propri meccanismi di riparazione e protezione25,26. L’equilibrio di N e C è importante per regolare la crescita, e P in particolare27, che può manifestarsi come una regolazione dinamica dell’abbondanza dei simbionti. In effetti, le prove raccolte dai coralli attraverso grandi distese di barriera corallina (>1.000 km) suggeriscono che gli ospiti hanno la capacità di limitare la crescita dei simbionti attraverso la regolazione di P, anche se questo varia a seconda delle specie di corallo27.
Nel loro insieme, questi studi suggeriscono un aumento della tolleranza al calore con una concomitante diminuzione della produzione o della traslocazione di nutrienti (cioè la propensione alla simbiosi) a causa dei cambiamenti ambientali. Potenti metodi mono-giovanili, come la quantificazione dell’uso dell’ossigeno tramite micro-respirometria, dovrebbero quindi essere utilizzati per comprendere i meccanismi fondamentali relativi al metabolismo e quindi applicati a questioni di conservazione come la comprensione dell’acquisizione della tolleranza al calore. Questo è qui presentato come uno strumento di micro-respirometria per misure fisiologiche, destinato a indagare la relazione nutrizionale tra i giovani di corallo e i loro simbionti algali, ma adatto ad altri piccoli organismi marini.
L’uso o la produzione di ossigeno da parte degli organismi può essere misurato collocandoli in singole camere respirometriche ermeticamente sigillate o «respirometri» (di seguito “camere”), in cui la variazione di ossigeno viene misurata utilizzando optodi3. Gli optodi sono sonde che misurano la concentrazione di ossigeno utilizzando impulsi luminosi e la registrazione delle misurazioni nel tempo consente il calcolo dei tassi di respirazione e/o fotosintesi. In pratica, misurare la respirazione è simile alla misurazione della fotosintesi nei coralli, tranne per il fatto che i coralli vengono incubati nell’oscurità totale. Sottraendo la respirazione giornaliera totale del corallo e dei simbionti dalla fotosintesi giornaliera totale si ottiene un differenziale di ossigeno (delta di ossigeno)2,3. Generalmente, gli organismi utilizzano più ossigeno di quello che producono, con conseguente deficit. Questo può essere convertito in equivalenti di carbonio poiché l’ossigeno e il carbonio vengono consumati in un rapporto fisso2. Il surplus di carbonio può essere utilizzato dal corallo per la crescita, la sintesi e la riproduzione del muco e altre esigenze metaboliche essenziali12.
Questo protocollo descrive un metodo di microrespirazione (Figura 1) che è stato impiegato per misurare la frequenza respiratoria (R) per i singoli giovani di corallo utilizzando una camera di vetro da 1,5 mL su misura (fiala con filettatura GL25 e alta 20 mm, con protuberanza/cresta, bordo piatto e tappo a vite con foro; vedi Tabella dei materiali) riempita con acqua di mare filtrata da 0,5 μm. Gli optodi a fibre ottiche (vedi Tabella dei materiali) sono stati inseriti in ciascuna camera attraverso un foro sul lato del coperchio. Ogni singolo corallo è stato fissato sopra una piattaforma a rete rigida, una piastra di agitazione a flusso continuo sopra una barra di agitazione magnetica per garantire un’adeguata miscelazione dell’acqua all’interno della camera. Nell’esempio rappresentativo qui, due controlli o “blank” (camere identiche tranne che per la presenza del campione) sono stati misurati contemporaneamente alle tre camere del campione replicato, poiché avevamo più controller in funzione contemporaneamente. Tuttavia, l’esempio di configurazione (Figura 2) mostra solo l’uso di quattro canali; Questo può essere aumentato utilizzando più controller e più supporti a flusso continuo. La temperatura può anche essere controllata in questo sistema immergendo ogni camera in un bagno d’acqua su misura con temperature dell’acqua preimpostate (27 °C per il controllo o 31 °C per lo stress ad alta temperatura nei dati di esempio qui) utilizzando un sistema a flusso continuo (flusso continuo e delicato impostato a 75 L/h). La piattaforma della piastra dell’agitatore e la piastra dell’agitatore con ingranaggi possono essere di qualsiasi dimensione e possono essere realizzate grandi o piccole a seconda delle esigenze per adattarsi al numero di camere di vetro. In questo esempio, la piattaforma e il piatto misuravano circa 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabella dei materiali). La calibrazione degli optodi è stata eseguita prima di ogni corsa utilizzando due soluzioni standard che rappresentano lo 0% e il 100% di saturazione di ossigeno alla temperatura dell’acqua e alla salinità appropriate per questo ambiente sperimentale.
Questo lavoro delinea la costruzione di una configurazione di micro-respirometria su misura che può essere utilizzata per quantificare la quantità di ossigeno consumata e prodotta da piccoli organismi acquatici sessili. I componenti critici di questo protocollo includono la configurazione delle camere, compresi gli spot, e la calibrazione del segnale basso utilizzando il pacchetto respR , in cui un segnale basso può essere definito come velocità tipiche di pendii poco profondi o rumorosi. La camera personalizzata e la sua configurazione consentono il rilevamento anche di segnali bassi, mentre l’uso del pacchetto R aiuta a proteggersi da problemi in cui il verificarsi di pendii poco profondi o rumorosi potrebbe portare a un’errata interpretazione dei risultati (ad esempio, falsi positivi).
Le potenziali modifiche che saranno necessarie per altri utenti includono la messa in sicurezza dell’organismo di interesse all’interno della camera personalizzata. In questo caso, sono stati utilizzati una piccola fascetta rigida e una colla per acquari per fissare il singolo giovane alla base di plastica, che è stata poi incollata alla fascetta. Va notato che, per questo esperimento, i giovani di corallo sono stati sistemati su teli di plastica nera. Questa plastica ha permesso una facile rimozione dei giovani di corallo, che sono scivolati via dalla plastica, in modo da non danneggiarli fisicamente durante la rimozione. I novellami di corallo si fissano al substrato su cui si depositano, quindi si consiglia di depositarli su materiale plastico simile, utilizzando un peptideartificiale 16 per facilitarne la rimozione per il processo di incollaggio. Per ridurre ulteriormente lo stress da manipolazione e l’impatto sulla risposta respiratoria, si raccomanda di consentire ai coralli montati su fascette di acclimatarsi per 1-2 settimane, come è comune in molti esperimenti di stress sui coralli adulti. Potrebbero essere necessarie altre modifiche per fissare l’organismo sopra il punto nel coperchio e per consentire la circolazione dell’acqua. Un’altra fase chiave per la risoluzione dei problemi riguarda il rilevamento del segnale, in particolare sulla pendenza della serie temporale dell’ossigeno in cui devono essere determinati i tassi. In definitiva, ciò si riduce a una combinazione di utilizzo del buon senso per escludere dati ovviamente instabili e funzioni all’interno di respR per consentire l’estrazione di tassi da regioni scelte in modo coerente o automaticamente identificando regioni lineari dei dati. Ulteriori esempi di come farlo sono disponibili sul sito web di respR .
Questo metodo è stato sviluppato per estendere le misurazioni del limite inferiore della respirazione a invertebrati marini estremamente piccoli e sessili. L’ovvia limitazione è che questo protocollo può essere più incline ai falsi positivi rispetto ai protocolli progettati per biomasse più grandi. Tuttavia, dato che questo era lo scopo del progetto, misurare questi limiti inferiori, questo è stato preso in considerazione nella progettazione e la procedura può essere utilizzata con il pacchetto respR per proteggersi meglio dai falsi positivi. È anche importante riconoscere che esistono altri sistemi per misurare la respirazione30 e la misurazione di piccoli organismi, inclusa la respirometria su singoli copepodi31 in volumi più piccoli di questo (~0,5-1 mL), ma sono costosi o mancano di componenti specifici (capacità di agitazione). Tuttavia, questo sistema è open-source e di costo relativamente basso rispetto ai sistemi commerciali (ad esempio, il sistema Core Microplate). Questo sistema incorpora anche considerazioni metodologiche chiave come l’agitazione, che altri sistemi potrebbero non avere. La funzione di barra di agitazione interna è essenziale per replicare il naturale rimescolamento dell’acqua di molti organismi marini (ad esempio, i copepodi attraverso il nuoto), che spesso non è possibile e può rendere i dati in gran parte inutilizzabili. Al contrario, altri metodi di miscelazione disponibili prevedono il posizionamento dell’intero respirometro su un gigantesco banco a bilanciere, che richiede attrezzature aggiuntive e ha un successo limitato nella miscelazione, o la miscelazione tramite vibrazione, che può causare disturbi all’organismo. Per questo motivo, questo è l’unico sistema in grado di eseguire respirometria su coralli giovani o altri organismi sessili molto piccoli. A titolo di riferimento, l’intervallo di dimensioni degli esemplari qui inclusi variava da 2,1 a 3,6 polipi (corrispondenti a pochi mesi di età), con un’area media da minima a massima compresa tra 1,3 e 4,5 mm2.
La respirometria è una misura fondamentale negli studi ecologici ed esistono molti metodi per questo scopo. La maggior parte di questi metodi esistenti, tuttavia, si rivolge a campioni ad alta biomassa, tra cui pesci interi, frammenti di corallo o fanerogame marine 32,33,34. Questo metodo è il primo a utilizzare singoli giovani di corallo. Inoltre, ci sono molte potenziali applicazioni per questo metodo, in quanto fornisce informazioni fisiologiche chiave sul funzionamento dell’organismo. Questo può essere importante per gli studi che cercano di caratterizzare le stime di salute di base35, comprendere il ruolo dello stress acuto o a lungo termine durante l’ontogenesi dei coralli come lo stress da calore36 o fornire soglie che i gestori possono impostare per aiutare a proteggere e migliorare la salute delle barriere coralline37. Dato che il corallo è un olobionte e la comunità simbionte è relativamente flessibile in questa fase e per tutto il primo anno di vita38, sarebbe interessante accoppiare i dati di respirometria con i cambiamenti nelle comunità nel tempo, per contestualizzare completamente il funzionamento dell’organismo nel suo complesso. È importante sottolineare che questo metodo contribuisce alle tecniche di “scienza aperta” che aiutano a fornire uno schema per la creazione di configurazioni sperimentali personalizzate che possono essere condivise, migliorate e standardizzate apertamente.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Sam Noonan per il suo aiuto e i suoi consigli, Sven Uthicke per l’uso delle camere di respirometria iniziale, Ben Shelab per la sua illustrazione ingegneristica e il laboratorio dell’Australian Institute of Marine Science per la lavorazione su misura degli adattatori e dei supporti della camera di respirometria. I coralli sono stati raccolti con il seguente permesso del Parco Marino della Grande Barriera Corallina all’AIMS G12/ 35236.1. I coralli non richiedono permessi etici.
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |