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Medicine

Palmitic Acid-Induced In Vitro 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 Platycodin D의 보호 효과 조사

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜은 팔미트산 유발 시험관 내 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 platycodin D의 보호 효과를 조사합니다.

Abstract

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 발생은 전 세계적으로 놀라운 속도로 증가하고 있습니다. Platycodon grandiflorum 은 다양한 질병의 치료를위한 전통적인 민족 의학으로 널리 사용되며 일상 식단에 포함될 수있는 대표적인 기능성 식품입니다. 연구에 따르면 Platycodon grandiflorum의 주요 활성 성분 중 하나인 platycodin D(PD)는 생체이용률이 높고 NAFLD의 진행을 크게 완화하지만 이에 대한 기본 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 본 연구는 시험관 내에서 NAFLD에 대한 PD의 치료 효과를 조사하는 것을 목적으로 한다. AML-12 세포는 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위해 24시간 동안 300μM 팔미트산(PA)으로 전처리되었습니다. 이어서, 세포를 PD로 처리하거나 24시간 동안 PD 치료를 받지 않았다. 활성 산소종(ROS)의 수준은 2′,7′-디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 분석되었으며, 미토콘드리아 막 전위는 JC-1 염색 방법으로 측정되었습니다. 또한, 세포 용해물에서 LC3-II/LC3-I 및 p62/SQSTM1의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 ROS 및 미토콘드리아 막 전위 수준을 유의하게 감소시키는 것으로 나타났다. 한편, PD는 대조군에 비해 PA 처리군에서 LC3-II/LC3-I 수준을 증가시키고 p62/SQSTM1 수준을 감소시켰습니다. 결과는 PD가 산화 스트레스를 줄이고 자가포식을 자극하여 시험관 내에서 NAFLD를 개선한다는 것을 나타냅니다. 이 시험관 내 모델은 NAFLD에서 PD의 역할을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG)는 Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC.는 중국 전통 의학(TCM)에서 사용됩니다. 주로 중국의 북동부, 북부, 동부, 중부 및 남서부 지역에서 생산됩니다1. PG 성분에는 트리테르페노이드 사포닌, 다당류, 플라보노이드, 폴리페놀, 폴리에틸렌 글리콜, 휘발성 오일 및 미네랄이 포함됩니다2. PG는 아시아에서 식품 및 약초로 사용되어 온 오랜 역사를 가지고 있습니다. 전통적으로이 약초는 폐 질환에 대한 약을 만드는 데 사용되었습니다. 현대 약리학은 또한 다른 질병을 치료하기 위한 PG의 효능에 대한 증거를 제공합니다. 연구에 따르면 PG는 다양한 약물 유발 간 손상 모델에서 치료 효과가 있습니다. PG 또는 platycodin 추출물의 식이 보충제는 고지방 식단으로 인한 비만 및 관련 대사 질환을 개선할 수 있습니다 3,4,5. PG의 다당류는 생쥐의 LPS/D-GalN에 의한 급성 간 손상 치료에 사용할 수 있다6. 또한 PG 뿌리의 사포닌은 고지방 식단으로 유발된 비알코올성 지방간염(NASH)을 개선합니다.7. 또한, PG의 가장 중요한 치료 성분 중 하나인 platycodin D(PD)는 인간 간세포 암종(HepG2) 세포에서 저밀도 지단백 수용체 발현과 저밀도 지단백 흡수를 향상시킬 수 있다8. 또한, PD는 또한 세포자멸사를 유도하고 HepG2 세포에서 부착, 이동 및 침윤을 억제할 수 있다 9,10. 따라서 본 연구에서는 마우스 간암 AML-12 세포를 시험관 내 모델 구축에 사용하고 이 모델에서 PD의 약리학적 효과 및 기본 메커니즘을 추가로 연구합니다.

비알코올성 지방간장(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 단순 지방증, NASH, 간경변증, 간세포암종 등을 포함하는 간 질환을 일컫는 일이다11. NAFLD의 발병기전은 불완전하게 이해되었지만 고전적인 "2히트" 이론에서 현재의 "멀티플 히트" 이론에 이르기까지 인슐린 저항성은 NAFLD12,13,14의 발병기전에서 핵심적인 것으로 간주됩니다. 연구에 따르면 간세포의 인슐린 저항성은 유리 지방산을 증가시켜 간에 축적되는 트리글리세리드를 형성하고 간을 지방으로 만들 수 있음이 입증되었습니다15,16. 지방의 축적은 지방 독성, 산화 스트레스로 인한 미토콘드리아 기능 장애, 소포체 스트레스 및 염증성 사이토카인 방출을 유발하여 NAFLD17,18의 발병 및 진행을 초래할 수 있습니다. 또한, 자가포식은 세포 인슐린 감수성, 세포 지질 대사, 간세포 손상 및 선천성 면역 조절에 관여하기 때문에 NAFLD의 발병기전에도 중요한 역할을 합니다 19,20,21.

NAFLD22,23의 발병기전 및 잠재적 치료 표적을 탐색하기 위한 기초를 제공하기 위해 다양한 동물 모델 및 세포 모델이 확립되었습니다. 그러나 단일 동물 모델은 NAFLD24의 모든 병리학적 과정을 완전히 모방할 수 없습니다. 동물 간의 개인차는 병리학 적 특징을 다르게 유도합니다. NAFLD의 시험관 내 연구에서 간 세포주 또는 일차 간세포를 사용하면 실험 조건에서 최대 일관성을 보장합니다. 간 지질 대사 조절 장애는 NAFLD25에서 더 높은 수준의 간세포 지질 액적 축적으로 이어질 수 있습니다. 올레산 및 팜유와 같은 유리 지방산은 고지방 식단으로 인한 NAFLD를 모방하기 위해 시험관 내 모델에서 사용되었습니다26,27. 인간 간모세포종 세포주 HepG2는 시험관 내에서 NAFLD 모델을 구축하는 데 자주 사용되지만, 종양 세포주로서 HepG2 세포의 대사는 정상적인 생리학적 조건에서 간 세포의 대사와 크게 다르다28. 따라서, 약물 스크리닝을 위한 시험관내 NAFLD 모델을 구축하기 위해 원발성 간세포 또는 마우스 일차 간세포를 사용하는 것이 종양 세포주를 사용하는 것보다 더 유리하다. 동물 모델과 시험관 내 간세포 모델 모두에서 약물 효과와 치료 표적의 시너지 조사를 비교하면 마우스 간세포를 사용하여 시험관 내 NAFLD 모델을 구성하는 것이 더 나은 응용 가능성을 갖는 것으로 보입니다.

간으로 들어가는 유리 지방산은 산화되어 에너지를 생성하거나 트리글리세리드로 저장됩니다. 중요한 것은, 유리지방산은 특정 지방독성을 가지고 있으며, 세포사멸 장애와 세포자멸사를 유발할 수 있다는 것이다12. 팔미트산(Palmitic acid, PA)은 인간 혈장에 가장 풍부한 포화 지방산이다29. 비지방 조직의 세포가 고농도의 PA에 장시간 노출되면 활성 산소종(ROS)의 생성을 자극하고 산화 스트레스, 지질 축적, 심지어 세포자멸사를 유발합니다30. 따라서 많은 연구자들은 PA를 유도제로 사용하여 간 세포가 ROS를 생성하도록 자극하여 시험관 내 지방간 질환 모델을 구성하고 세포에 대한 특정 활성 물질의 보호 효과를 평가합니다31,32,33,34. 이 연구는 PA에 의해 유도된 NAFLD의 세포 모델에 대한 PD의 보호 효과를 조사하기 위한 프로토콜을 소개합니다.

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Protocol

AML-12 세포(정상 마우스 간세포 세포주)는 세포 기반 연구에 사용됩니다. 세포는 상업적 공급원으로부터 얻어진다 ( 재료 표 참조).

1. 시험관 내에서 NAFLD를 모델링하기 위한 AML-12 세포의 전처리

  1. 세포를 정상 세포 배양 배지 (0.005 mg/mL 인슐린, 5 ng/mL 셀레늄, 0.005 mg/mL 트랜스페린, 40 ng/mL 덱사메타손, 및 10% 소 태아 혈청 [FBS]를 함유하는 DMEM 플러스 Ham's F12 [1:1], 재료 표 참조)를 5%CO2로 가습된 분위기에서 37°C로 유지한다.
  2. 2.8 x 105 cells/well의 밀도로 12웰 플레이트(1mL/well)에 세포를 시딩합니다.
    참고: 모든 세포 분해 및 배지 교환 작업은 세포 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
  3. 하룻밤 배양(~10시간) 후 세포의 배양 배지를 제거한 다음 1mL의 무혈청 배지(웰당)로 세포를 두 번 세척합니다.
  4. 12웰 세포 플레이트를 (1) 대조군, (2) PD 처리군, (3) PA 처리군, (4) PA+PD 처리군을 포함하여 왼쪽에서 오른쪽으로 4개의 다른 처리군으로 나눕니다.
    참고: 각 실험 처리 그룹의 3회 반복이 동일한 12웰 세포 플레이트에 위에서 아래로 배열됩니다.
  5. 정상세포배양액(1mL/웰)을 대조군과 PD처리군에 추가하고, PA처리군과 PA+PD처리군에 300μM의 PA가 보충된 정상세포배양액(1mL/웰)을 추가한다.
  6. 배양 24시간 후 세포의 배양액을 제거하고, 세포를 1 mL의 무혈청 배지(웰당)로 2회 세척하였다.
  7. 비히클(디메틸 설폭사이드, DMSO, 0.1% v/v)이 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 대조군에 추가합니다. 1μM PD가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 PD 처리군에 추가합니다. PA 처리군에 300μM PA가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 추가합니다. 300μM PA 및 1μM PD가 보충된 정상 세포 배양 배지(1mL/웰)를 PA + PD 처리군에 추가합니다.
  8. 추가 24시간 동안 배양한 후 2′,7′-디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색(2단계), JC-1 염색(3단계) 및 웨스턴 블로팅(4단계)을 사용하여 세포에 대한 PD의 보호 효과를 조사합니다.
    참고: 모든 배양 작업은 5%CO2의 가습 분위기에서 37°C에서 수행됩니다.

2. ROS 생산의 변화 측정

참고: 세포의 세포 내 ROS 수준은 DCFH-DA 염색 분석을 기반으로 평가됩니다.

  1. 처리 기간(단계 1.8)이 끝날 때, 웰당 1 mL의 인산염 완충 식염수(1x PBS, pH 7.4)로 세포를 3회 세척한 다음, 웰당 10 μM의 10 μM DCFH-DA로 세포를 염색한다( 재료 표 참조). 세포를 어둠 속에서 30분 동안 배양한다.
    참고: 배양 30분 후에도 뚜렷한 녹색 형광이 관찰되지 않으면 프로브와 세포의 배양 시간을 적절하게 늘릴 수 있습니다(30-60분). 배양 30분 후 녹색 형광 값의 과다 노출이 관찰되면 프로브 및 세포의 배양 시간을 적절하게 줄일 수 있습니다(15-30분).
  2. 세포를 1x PBS(1mL/웰)로 세 번 세척합니다. 각 웰에 1x PBS 1mL를 추가합니다.
  3. 12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고( 재료 표 참조) 20x 대물렌즈를 사용하여 세포의 형태를 관찰합니다(배율: 200x).
  4. 여기 파장이 480nm이고 방출 파장이 530nm인 녹색 형광 채널을 사용하여 형광 현미경에서 각 웰에 대해 3개의 대표적인 형광 이미지(배율: 200x)를 캡처합니다.
    알림: 여기 파장이 480nm이고 방출 파장이 530nm인 녹색 형광 채널이 DCFH-DA를 감지하는 것이 좋습니다. 추가적으로, DCFH-DA는 형광 현미경35,36에서 GFP 및 FITC에 대한 파라미터 설정으로 검출될 수 있다.
  5. 마지막으로, 이미지 획득 소프트웨어( 재료 표 참조)로 이미지를 처리한 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 평균 형광 강도 또는 다른 그룹의 비율을 계산합니다.
    참고: 이미징 작업에 사용된 형광 현미경 및 Image J 소프트웨어의 기술적 세부 사항은 이전에설명되었습니다 37,38.

3. 미토콘드리아 막 전위의 변화 측정

참고: 미토콘드리아 막 전위의 변화는 JC-1 염색 분석에 의해 모니터링됩니다.

  1. 처리 기간(단계 1.8)이 끝나면 웰당 1mL의 1x PBS로 세포를 3회 세척한 다음 5μg/mL JC-1 작업 용액 100μL( 재료 표 참조)로 암실에서 37°C에서 30분 동안 세포를 염색합니다.
    참고: 배양 30분 후에도 뚜렷한 녹색 형광이 관찰되지 않으면 프로브와 세포의 배양 시간을 적절하게 늘릴 수 있습니다(30-60분). 배양 30분 후 녹색 형광 값의 과다 노출이 관찰되면 프로브 및 세포의 배양 시간을 적절하게 줄일 수 있습니다(15-30분).
  2. 세포를 1x PBS(1mL/웰)로 세 번 세척합니다. 각 웰에 1x PBS 1mL를 추가합니다.
  3. 12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 20x 대물렌즈를 사용하여 세포의 형태를 관찰합니다(배율: 200x).
  4. 여기 및 방출 파장이 각각 485nm 및 535nm인 녹색 형광 채널과 여기 및 방출 파장이 각각 550nm 및 600nm인 적색 형광 채널을 사용하여 형광 현미경에서 각 웰에 대한 3개의 대표적인 형광 이미지(배율: 200x)를 캡처합니다.
    참고 : 여기 파장이 485nm이고 방출 파장이 535nm인 녹색 형광 채널은 탈분극된 미토콘드리아 39,40,41로 취급되는 JC-1 단량체를 검출하는 데 사용되며, 여기 파장이 550nm이고 방출 파장이 600nm인 적색 형광 채널은 JC-1 이량체를 검출하는 데 사용됩니다. 이는 편광된 미토콘드리아 39,40,41로 취급됩니다.
  5. 마지막으로, 이미지 획득 소프트웨어로 이미지를 처리한 다음 Image J 소프트웨어를 사용하여 각 그룹의 평균 형광 강도 또는 다른 그룹의 비율을 계산합니다.
    참고: 이미징 작업에 사용된 형광 현미경 및 Image J 소프트웨어의 기술적 세부 사항은 이전에설명되었습니다 37,38.

4. LC3-II/LC3-I 및 p62/SQSTM1의 단백질 발현량 측정

  1. 처리 후(단계 1.8), 4°C에서 예냉각된 1x PBS(1mL/웰)로 세포를 3회 세척합니다.
  2. 프로테아제와 포스파타제 억제제 칵테일(1x)( 재료 표 참조)이 보충된 RIPA 용해 완충액(100μL/웰)을 12웰 플레이트에 넣고 얼음에서 5분 동안 용해합니다.
  3. 세포 용해물을 1.5mL 미세원심분리 튜브에 수집하고, 4°C에서 20분 동안 12,000 x g 로 원심분리한다. 상청액의 단백질 농도를 표준 절차42에 따라 BCA 방법에 의해 결정한다.
  4. SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼(5x, 재료 표 참조)를 세포 용해물 상층액(부피 비율 = 1:4)에 추가합니다.
  5. 와동(~15초 동안 고속으로)으로 혼합하고 혼합된 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다.
  6. 12-well-prepared 12% SDS-PAGE gel을 전기영동조에 넣은 후, 초순수로 희석한 SDS up-sample buffer(1x)를 높이한계 위치에 올려 놓는다.
    알림: SDS-PAGE 젤은 제조업체의 지침에 따라 상업용 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 준비됩니다.
  7. 단백질 마커(5μL/웰)와 샘플(20μg/웰)을 SDS-PAGE 젤의 다른 웰에 추가합니다.
  8. 안정전압 모드를 100V로 설정하고 80분 동안 전기영동을 수행합니다.
  9. SDS-PAGE 전기영동 후, 이전에 발표된 보고서 43,44에 따라 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(0.45 μM, 재료 표 참조)으로 단백질의 전기전달을 수행합니다.
  10. 단백질의 전전 후 PVDF 멤브레인을 TBST(1x TBS, 0.1% 트윈 20) 10mL로 실온의 셰이커에서 2회(5분/회) 세척합니다.
  11. PVDF 멤브레인을 5mL의 소혈청알부민(BSA, 5%)으로 실온에서 1시간 동안 쉐이커로 차단합니다.
  12. PVDF 멤브레인을 10mL의 TBST로 세 번(10분/회) 세척합니다. 이어서, 4°C에서 밤새 LC3(마우스 mAb, 1:2,000), p62/SQSTM1(이하 p62, 마우스 mAb, 1:2,000) 및 β-액틴(마우스 mAb, 1:2,000)( 재료 표 참조)에 대한 블로킹 완충액에 희석된 특정 1차 항체 5mL에 PVDF 멤브레인을 배양합니다.
  13. PVDF 멤브레인을 TBST 10mL로 실온에서 3회(10분/회) 세척합니다. 이어서, PVDF 멤브레인을 실온에서 블로킹 완충액(1:10,000)( 재료 표 참조)에 희석된 토끼 항-마우스 IgG(HRP) 2차 항체와 함께 인큐베이션하고 2시간 동안 빛으로부터 보호하였다.
  14. PVDF 멤브레인을 TBST 10mL로 실온에서 3회(10분/회) 세척합니다. 그런 다음 플라스틱 랩에 PVDF 멤브레인을 놓고 적절한 양의 ECL 작업 용액(200μL/멤브레인)을 추가하고( 재료 표 참조) 2분 동안 배양합니다.
  15. 배양 후 ECL 작업 용액을 제거하고 이미지 현상을 위해 이미징 시스템에 PVDF 멤브레인을 노출시킵니다. 마지막으로 Image J 소프트웨어를 사용하여 각 밴드의 회색 값을 분석합니다.
    참고: 이미징 작업에 사용된 웨스턴 블로팅 및 이미지 J 소프트웨어의 기술적 세부사항은 이전에 설명되었습니다45,46.

5. 통계 분석

  1. 실험 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시합니다.
  2. 앞서 설명한 통계 소프트웨어 도구를 사용하여 유의성 분석을 수행합니다47.
  3. t-검정을 사용하여 두 그룹 간의 통계적 차이를 계산합니다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005).

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Representative Results

세포의 세포 내 ROS
AML-12 세포를 24시간 동안 300μM PA로 유도하고 NAFLD 세포 모델을 확립했습니다. 이어서, 세포를 24시간 동안 PD로 처리하였다. 세포를 DCFH-DA 형광 프로브로 표지하고, 형광현미경으로 ROS 생성을 관찰하였다. 세포내 ROS의 DCFH-DA 염색 결과를 도 1에 나타내었다. 결과는 PD가 300μM의 PA(P < 0.01)로 배양된 세포에서 세포내 ROS 수준을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 PD가 세포 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 나타냅니다.

세포의 미토콘드리아 막 전위
미토콘드리아는 내인성 세포 사멸 경로48,49,50에 의해 지배되는 중심 세포 기관입니다. 따라서, 24시간 동안 PD와 함께 배양된 AML-12 세포의 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 JC-1 염색 후 형광현미경으로 관찰하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, PA가 처리된 세포에서 녹색 형광(JC-1 단량체, 탈분극된 미토콘드리아로서 39,40,41)은 처리되지 않은 세포에서보다 더 높았다. 반면, PA가 처리된 세포에서 적색 형광(JC-1 dimers, 39,40,41로 처리된 편광된 미토콘드리아)은 처리되지 않은 세포에서보다 낮았으며, 이는 세포에서 PA가 유도한 MMP 탈분극을 나타낸다. 또한, 모델군과 비교하여 PD 처리군에서 JC-1 단량체:이량체의 비율이 감소하여(P < 0.01), PD가 PA 유도 MMP 탈분극을 개선할 수 있음을 나타냅니다.

LC3-II/LC3-I 및 p62의 단백질 발현 수준
이 연구는 또한 웨스턴 블랏팅을 통해 세포에서 자가포식 관련 단백질 LC3 및 p62의 단백질 발현 수준을 조사하여 자가포식 경로에서 PD의 잠재적 역할을 조사했습니다. 도 3에 나타난 바와 같이, LC3-II:LC3-I의 비율은 유의하게 감소하였고(P< 0.005), 48시간 동안 PA로 처리한 후 p62의 단백질 발현량이 증가하였다(P< 0.01). 한편, PD는 p62의 단백질 발현 수준을 유의하게 감소시키고(P< 0.01) LC3-II:LC3-I의 비율을 증가시킬 수 있으며(P < 0.05), 이는 PD가 PA에 의해 억제된 자가포식 플럭스를 회복시킬 수 있음을 나타냅니다.

Figure 1
그림 1: DCFH-DA 염색으로 평가한 세포의 세포내 ROS에 대한 PD의 효과 . (A) ROS 생성은 형광 현미경, 200x에 의해 검출되었다. 스케일 바: 20μm. (B) 다른 그룹에서 ROS 수준의 상대적 배수 변화. 각 열은 평균 ± SD(n=3)를 나타냅니다. **P < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: JC-1 염색에 의해 평가된 세포에서의 MMP 탈분극에 대한 PD의 효과. (a) MMP 탈분극은 형광 현미경, 200x에 의해 검출되었다. 스케일 바: 20μm. (B) 다른 그룹에서 JC-1 단량체:이량체 비율의 상대적 변화. 각 열은 평균 ± SD(n=3)를 나타냅니다. **P < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 웨스턴 블랏팅으로 평가한 세포 내 LC3-II/LC3-I 및 p62의 단백질 발현 수준에 대한 PD의 효과. (A) LC3, p62 및 β-액틴의 단백질 수준을 웨스턴 블로팅으로 검출하였다. (B) 다른 그룹에서 LC3-II:LC3-I 비율의 상대적 변화. (C) 상이한 군에서 p62 발현의 상대적 배수 변화. 각 열은 평균 ± SD(n=3)를 나타냅니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

연구에 따르면 NAFLD는 지방간에서 NASH에 이르는 임상 병리학 적 증후군으로 간경변 및 간암으로 진행될 수 있습니다51. 고지방 식단과 비활동적인 생활 방식은 NAFLD의 전형적인 위험 요소입니다. NAFLD 치료를 위한 비약물 요법과 약물 요법 모두 연구되었다51,52,53. 그러나 NAFLD의 발병기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 여기에 설명된 방법은 PA 자극 AML-12 세포에 의해 확립된 NAFLD의 시험관내 모델을 포함합니다. 우리는 이 모델에서 NAFLD에 대한 PD의 보호 효과를 조사했으며 PD가 PA에 의해 유도된 ROS 증가를 약화시킨다는 것을 발견했습니다. 게다가, PD는 또한 PA에 의해 유도된 MMP 탈분극을 개선하였다. 또한, PD는 p62의 단백질 발현 수준을 현저히 감소시키고 LC3-II:LC3-I의 비율을 증가시킬 수 있습니다. 이러한 실험 결과는 NAFLD 치료를 위한 활성 제약 성분으로서 PD의 적용을 위한 기초를 제공할 수 있습니다.

주요 세포 내 분해 경로로서, 자가포식은 세포19,54의 과잉 성분을 분해함으로써 영양 원료를 재활용하고 재사용하는 생리학적 과정을 실현합니다. 자가포식은 또한 신체가 "음양 균형"을 유지하기 위한 핵심 복구 메커니즘이며 TCM55,56,57에서 "기 변환"의 미시적 구현입니다. 본 프로토콜에서는 ROS 생성 및 MMP 탈분극의 변화를 검출하는 것 외에도 웨스턴 블랏팅에 의해 자가포식 관련 단백질 LC-3 및 p62의 단백질 발현 수준을 검출함으로써 자가포식 경로에서 PD의 잠재적 역할을 조사했습니다. PA 유도 세포를 PD로 처리한 후 LC3-II:LC3-I의 비율이 감소하고 p62의 축적이 증가하여 자가포식 수준이 감소했음을 나타냅니다. 실험 결과는 다른 문헌 보고서 20,34,58,59와 일치한다. 이 시험관 내 세포 모델은 PD의 생물학적 기능에 대한 이해를 높이고 NAFLD 치료를 위한 다른 활성 TCM 물질의 사용을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

실험 과정에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 시험관내 NAFLD 모델이 성공적으로 확립되었는지 여부를 결정하기 위해, 지질 액적 침착물은 이전에 기술된 바와 같이, 오일 레드 O 염색에 의해 정상 대조군 및 PA 처리군 세포에서 비교될 수 있다60,61. DCFH-DA 염색 또는 JC-1 염색 후, 세포에 들어 가지 않는 나머지 프로브는 씻어 내야합니다. 그렇지 않으면 형광 이미지를 촬영할 때 배경이 높아집니다. 또한 실험 오류 가능성을 줄이기 위해 형광 프로브(DCFH-DA 또는 JC-1)의 로딩과 측정 사이의 시간(배양 시간 제외)을 단축해야 합니다. 또한, 음성 대조군 세포의 형광 값이 상대적으로 높은 경우 형광 프로브(DCFH-DA 또는 JC-1)의 작업 농도를 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 또는, JC-1 작용용액 및 세포의 배양 시간은 실제 실험 조건에 따라 15-60분의 시간 프레임 내에서 적절히 조절될 수 있다.

이 시험관 내 세포 모델에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 간 실질 세포, 간 성상 세포, 쿠퍼 세포 및 혈관 내피 세포와 같은 세포가 간 조직에 존재한다62. 따라서 간 실질 세포에 대한 실험만으로는 약물의 효과를 설명하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 다른 세포 모델도 항 NAFLD 약물 발견에 사용해야합니다. 또한, 3 차원 (3D) 세포 배양 시스템은 간 모델을 구성하고 간독성을 시험하기 위해 사용되어왔다63,64. 향후 연구는 잠재적인 항-NAFLD 약물 스크리닝을 위해 공동 배양 및 3D 세포 배양 기술을 사용하여 시험관 내 모델을 개발하는 데 중점을 둘 것입니다.

다계통 질환으로서 많은 요인이 NAFLD의 발달 및 진행에 중요한 역할을 하며, 이는 단일 동물 모델 또는 세포 모델이 이 질병의 모든 병리학적 과정을 완전히 모방할 수 없음을 의미합니다65. 동물 모델 사용에 대한 과도한 의존은 치료제 개발의 부담을 증가시킵니다. 항 NAFLD 약물 개발의 초기 단계에서 시험관 내 세포 모델을 사용하는 것이 더 실용적이고 비용 효율적입니다. 본 연구에서는 정상 마우스 간세포 세포주 AML-12를 이용하여 NAFLD의 시험관 내 모델을 구성하였으며, 이 모델에서 PD의 치료 효과를 검증하였다. 특히, 이 연구의 결과는 생쥐 간세포 및 원발성 간세포 모델에서 PD의 항-NAFLD 효과에 대한 추가 연구의 기초를 제공합니다.

결론적으로, NAFLD에 대한 PD의 보호 효과를 연구하기 위한 시험관 내 모델이 여기에 제시됩니다. 이것은 또한 NAFLD의 치료를 위한 TCM의 다른 활성 물질의 효능을 조사하기 위한 시험관내 모델이 될 수 있다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 충칭 과학 기술위원회 (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky20200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013 및 jbky20210029)와 중국 박사후 과학 재단 (No. 2021MD703919)의 보조금으로 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

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References

  1. Xunyan, X. Y., Fang, X. M. The effect of Platycodon grandiflorum and its historical change in the clinical application of Platycodonis radix. Zhonghua Yi Shi Za Shi. 51 (3), 167-176 (2021).
  2. Ma, X., et al. Platycodon grandiflorum extract: Chemical composition and whitening, antioxidant, and anti-inflammatory effects. RSC Advances. 11 (18), 10814-10826 (2021).
  3. Ke, W., et al. Dietary Platycodon grandiflorus attenuates hepatic insulin resistance and oxidative stress in high-fat-diet induced non-alcoholic fatty liver disease. Nutrients. 12 (2), 480 (2020).
  4. Kim, Y. J., et al. Platycodon grandiflorus root extract attenuates body fat mass, hepatic steatosis and insulin resistance through the interplay between the liver and adipose tissue. Nutrients. 8 (9), 532 (2016).
  5. Park, H. M., et al. Mass spectrometry-based metabolomic and lipidomic analyses of the effects of dietary Platycodon grandiflorum on liver and serum of obese mice under a high-fat diet. Nutrients. 9 (1), 71 (2017).
  6. Qi, C., et al. Platycodon grandiflorus polysaccharide with anti-apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory activity against LPS/D-GalN induced acute liver injury in mice. Journal of Polymers and the Environment. 29 (12), 4088-4097 (2021).
  7. Choi, J. H., et al. Saponins from the roots of Platycodon grandiflorum ameliorate high fat diet-induced non-alcoholic steatohepatitis. Biomedicine & Pharmacotherapy. 86, 205-212 (2017).
  8. Choi, Y. J., et al. Platycodin D enhances LDLR expression and LDL uptake via down-regulation of IDOL mRNA in hepatic cells. Scientific Reports. 10, 19834 (2020).
  9. Li, T., et al. Platycodin D triggers autophagy through activation of extracellular signal-regulated kinase in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. European Journal of Pharmacology. 749, 81-88 (2015).
  10. Lu, J. -J., et al. Proteomic analysis of hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with platycodin D. Chinese Journal of Natural Medicines. 13 (9), 673-679 (2015).
  11. Neuschwander-Tetri, B. A. Therapeutic landscape for NAFLD in 2020. Gastroenterology. 158 (7), 1984-1998 (2020).
  12. Friedman, S. L., Neuschwander-Tetri, B. A., Rinella, M., Sanyal, A. J. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies. Nature Medicine. 24 (7), 908-922 (2018).
  13. Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (1), 99-128 (2019).
  14. Buzzetti, E., Pinzani, M., Tsochatzis, E. A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Metabolism. 65 (8), 1038-1048 (2016).
  15. Watt, M. J., Miotto, P. M., De Nardo, W., Montgomery, M. K. The liver as an endocrine organ-Linking NAFLD and insulin resistance. Endocrine Reviews. 40 (5), 1367-1393 (2019).
  16. Khan, R. S., Bril, F., Cusi, K., Newsome, P. N. Modulation of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 70 (2), 711-724 (2019).
  17. Karkucinska-Wieckowska, A., et al. Mitochondria, oxidative stress and nonalcoholic fatty liver disease: A complex relationship. European Journal of Clinical Investigation. 52 (3), 13622 (2022).
  18. Tilg, H., Adolph, T. E., Dudek, M., Knolle, P. Non-alcoholic fatty liver disease: The interplay between metabolism, microbes and immunity. Nature Metabolism. 3 (12), 1596-1607 (2021).
  19. Qian, H., et al. Autophagy in liver diseases: A review. Molecular Aspects of Medicine. 82, 100973 (2021).
  20. Du, J., Ji, Y., Qiao, L., Liu, Y., Lin, J. Cellular endo-lysosomal dysfunction in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Liver International. 40 (2), 271-280 (2020).
  21. Allaire, M., Rautou, P. E., Codogno, P., Lotersztajn, S. Autophagy in liver diseases: Time for translation. Journal of Hepatology. 70 (5), 985-998 (2019).
  22. Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11963-11980 (2013).
  23. Lau, J. K., Zhang, X., Yu, J. Animal models of non-alcoholic fatty liver disease: Current perspectives and recent advances. The Journal of Pathology. 241 (1), 36-44 (2017).
  24. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: Lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  25. Carpino, G., et al. Increased liver localization of lipopolysaccharides in human and experimental NAFLD. Hepatology. 72 (2), 470-485 (2020).
  26. Vergani, L. Fatty acids and effects on in vitro and in vivo models of liver steatosis. Current Medicinal Chemistry. 26 (19), 3439-3456 (2019).
  27. Scorletti, E., Carr, R. M. A new perspective on NAFLD: Focusing on lipid droplets. Journal of Hepatology. 76 (4), 934-945 (2022).
  28. Green, C. J., Pramfalk, C., Morten, K. J., Hodson, L. From whole body to cellular models of hepatic triglyceride metabolism: Man has got to know his limitations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (1), 1-20 (2015).
  29. Gambino, R., et al. Different serum free fatty acid profiles in NAFLD subjects and healthy controls after oral fat load. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 479 (2016).
  30. Marra, F., Svegliati-Baroni, G. Lipotoxicity and the gut-liver axis in NASH pathogenesis. Journal of Hepatology. 68 (2), 280-295 (2018).
  31. Zhang, J., Zhang, H., Deng, X., Zhang, Y., Xu, K. Baicalin protects AML-12 cells from lipotoxicity via the suppression of ER stress and TXNIP/NLRP3 inflammasome activation. Chemico-Biological Interactions. 278, 189-196 (2017).
  32. Liang, Y., et al. γ-Linolenic acid prevents lipid metabolism disorder in palmitic acid-treated alpha mouse liver-12 cells by balancing autophagy and apoptosis via the LKB1-AMPK-mTOR pathway. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (29), 8257-8267 (2021).
  33. Peng, Z., et al. Nobiletin alleviates palmitic acid-induced NLRP3 inflammasome activation in a sirtuin 1dependent manner in AML12 cells. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5815-5822 (2018).
  34. Xu, T., et al. Ferulic acid alleviates lipotoxicity-induced hepatocellular death through the SIRT1-regulated autophagy pathway and independently of AMPK and Akt in AML-12 hepatocytes. Nutrition & Metabolism. 18 (1), 13 (2021).
  35. Aranda, A., et al. Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA) assay: A quantitative method for oxidative stress assessment of nanoparticle-treated cells. Toxicology in Vitro. 27 (2), 954-963 (2013).
  36. Eruslanov, E., Kusmartsev, S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods in Molecular Biology. 594, 57-72 (2010).
  37. Bankhead, P. Analyzing Fluorescence Microscopy Images with ImageJ. , Queen's University Belfast. Belfast, Ireland. (2014).
  38. Wiesmann, V., et al. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  39. Lugli, E., Troiano, L., Cossarizza, A. Polychromatic analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 7, Unit 7.32 (2007).
  40. Sivandzade, F., Bhalerao, A., Cucullo, L. Analysis of the mitochondrial membrane potential using the cationic JC-1 dye as a sensitive fluorescent probe. Bio-protocol. 9 (1), 3128 (2019).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  42. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , Humana Press. Totowa, NJ. 11-15 (2009).
  43. Goldman, A., Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current Protocols in Protein Science. 82, 1-16 (2015).
  44. Mozdzanowski, J., Speicher, D. W. Proteins from polyacrylamide gels onto PVDF membranes. Current Research in Protein Chemistry. , 87 (2012).
  45. Davarinejad, H. Quantifications of western blots with ImageJ. University of York. , Available from: http://www.yourku.ca/yisheng/internal/Protocols/Imagej.pdf (2015).
  46. Taylor, S. C., Posch, A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Research International. 2014, 361590 (2014).
  47. Motulsky, H. J. Graphpad Statistics Guide. Options for multiple t tests. Graphpad. , (2020).
  48. Poltorak, A. Cell death: All roads lead to mitochondria. Current Biology. 32 (16), 891-894 (2022).
  49. Dadsena, S., Jenner, A., García-Sáez, A. J. Mitochondrial outer membrane permeabilization at the single molecule level. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3777-3790 (2021).
  50. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305 (5684), 626-629 (2004).
  51. Lange, N. F., Radu, P., Dufour, J. F. Prevention of NAFLD-associated HCC: Role of lifestyle and chemoprevention. Journal of Hepatology. 75 (5), 1217-1227 (2021).
  52. Liu, X., Zhang, Y., Ma, C., Lin, J., Du, J. Alternate-day fasting alleviates high fat diet induced non-alcoholic fatty liver disease through controlling PPARalpha/Fgf21 signaling. Molecular Biology Reports. 49 (4), 3113-3122 (2022).
  53. Romero-Gomez, M., Zelber-Sagi, S., Trenell, M. Treatment of NAFLD with diet, physical activity and exercise. Journal of Hepatology. 67 (4), 829-846 (2017).
  54. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  55. Cui, B., Yu, J. M. Autophagy: A new pathway for traditional Chinese medicine. Journal of Asian Natural Products Research. 20 (1), 14-26 (2018).
  56. Law, B. Y., et al. New potential pharmacological functions of Chinese herbal medicines via regulation of autophagy. Molecules. 21 (3), 359 (2016).
  57. Zhou, H., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine monomer for treatment of non-alcoholic fatty liver disease. European Journal of Pharmacology. 898, 173976 (2021).
  58. Zhang, L., Yao, Z., Ji, G. Herbal extracts and natural products in alleviating non-alcoholic fatty liver disease via activating autophagy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1459 (2018).
  59. Zhang, X., et al. C-X-C motif chemokine 10 impairs autophagy and autolysosome formation in non-alcoholic steatohepatitis. Theranostics. 7 (11), 2822-2836 (2017).
  60. Li, C. X., et al. Allyl isothiocyanate ameliorates lipid accumulation and inflammation in nonalcoholic fatty liver disease via the Sirt1/AMPK and NF-kappaB signaling pathways. World Journal of Gastroenterology. 25 (34), 5120-5133 (2019).
  61. Li, S., et al. Sirtuin 3 acts as a negative regulator of autophagy dictating hepatocyte susceptibility to lipotoxicity. Hepatology. 66 (3), 936-952 (2017).
  62. Farrell, G. C., Teoh, N. C., McCuskey, R. S. Hepatic microcirculation in fatty liver disease. The Anatomical Record. 291 (6), 684-692 (2008).
  63. Milner, E., et al. Emerging three-dimensional hepatic models in relation to traditional two-dimensional in vitro assays for evaluating drug metabolism and hepatoxicity. Medicine in Drug Discovery. 8, 100060 (2020).
  64. Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: State of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
  65. Bilson, J., Sethi, J. K., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A multi-system disease influenced by ageing and sex, and affected by adipose tissue and intestinal function. Proceedings of the Nutrition Society. 81 (2), 146-161 (2022).

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Palmitic Acid-Induced <em>In Vitro</em> 모델에서 비알코올성 지방간 질환에 대한 Platycodin D의 보호 효과 조사
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Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

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