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환경과학

Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre

Published: January 06, 2023
doi:
10.3791/64860
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Ce protocole présente des tests de cytotoxicité couramment utilisés (tests Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red et MTT) adaptés à l’évaluation de la cytotoxicité dans des lignées cellulaires d’embryons de poisson zèbre (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits.

Abstract

Les lignées cellulaires de poissons sont de plus en plus utilisées dans les études d’écotoxicité, et des essais de cytotoxicité ont été proposés comme méthodes pour prédire la toxicité aiguë des poissons. Ainsi, ce protocole présente des tests de cytotoxicité modifiés pour évaluer la viabilité cellulaire dans des lignées cellulaires embryonnaires de poisson zèbre (Danio rerio) (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits. Les paramètres de cytotoxicité évalués sont l’intégrité mitochondriale (tests Alamar Blue [AB] et MTT), l’intégrité de la membrane via l’activité estérase (test CFDA-AM) et l’intégrité de la membrane lysosomale (test rouge neutre [NR]). Après l’exposition des substances d’essai dans une plaque de 96 puits, les essais de cytotoxicité sont effectués; ici, AB et CFDA-AM sont effectués simultanément, suivis de NR sur la même plaque, tandis que le test MTT est effectué sur une plaque séparée. Les lectures de ces tests sont prises par fluorescence pour AB et CFDA-AM, et absorbance pour MTT et NR. Les essais de cytotoxicité effectués avec ces lignées cellulaires de poissons peuvent être utilisés pour étudier la toxicité aiguë des substances chimiques sur les poissons.

Introduction

Les substances chimiques doivent être testées en ce qui concerne leur sécurité pour la santé humaine et l’environnement. Les biomarqueurs moléculaires et cellulaires sont de plus en plus pris en compte dans les évaluations de l’innocuité pour prédire les effets sur les organismes vivants par les organismes de réglementation et/ou les lois (p. ex. REACH, OCDE, US EPA)1,2, car ils peuvent précéder le résultat indésirable in vivo (p. ex. perturbation endocrinienne, réponse immunologique, toxicité aiguë, phototoxicité)3,4,5,6,7 . Dans ce contexte, la cytotoxicité a été prise comme mesure pour prédire la toxicité aiguë chez les poissons 5,8; Cependant, il peut avoir de nombreuses autres applications dans les études d’écotoxicité, telles que la définition des concentrations sous-cytotoxiques de substances chimiques pour étudier leur ensemble le plus diversifié d’effets sur les poissons (par exemple, les effets perturbateurs endocriniens).

Dans les systèmes de culture cellulaire (systèmes in vitro ), la cytotoxicité des substances chimiques peut être déterminée par des méthodes différentes selon les types de paramètres. Par exemple, une méthode de cytotoxicité peut être basée sur un paramètre lié à la morphologie spécifique observée au cours du processus de mort cellulaire, tandis qu’une autre peut déterminer la cytotoxicité par la mesure de la mort, de la viabilité et de la fonctionnalité cellulaires, de la morphologie, du métabolisme énergétique et de la fixation et de la prolifération cellulaires. Les substances chimiques peuvent affecter la viabilité cellulaire par différents mécanismes, de sorte qu’une évaluation de la cytotoxicité couvrant différents paramètres de viabilité cellulaire est nécessaire pour prédire les effets chimiques9.

MTT et Alamar Blue (AB) sont des tests qui déterminent les effets sur la viabilité cellulaire en fonction de l’activité métabolique cellulaire. Le test MTT évalue l’activité de l’enzyme mitochondriale succinate déshydrogénase10. La réduction du bromure jaunâtre de 3-[4,5-diméthylthiazol-2yl]-2,5-diphényltétrazolium (MTT) en bleu de formazan ne se produit que dans les cellules viables, et sa densité optique est directement proportionnelle au nombre de cellules viables10. Le test AB est un indicateur sensible d’oxydoréduction médié par des enzymes mitochondriales qui deviennent fluorescentes et changent de couleur lors de la réduction de la résazurine en résorunine par les cellules vivantes11; cependant, les enzymes cytosoliques et microsomiques contribuent également à la réduction de AB et MTT12. Ces enzymes peuvent inclure plusieurs réductases, telles que l’alcool et l’aldéhyde oxydoréductases, la NAD(P)H: quinone oxydoréductase, la flavine réductase, la NADH déshydrogénase et les cytochromes11.

Le test Neutral Red (NR) est un test de viabilité cellulaire basé sur l’incorporation de ce colorant dans les lysosomes de cellules viables13. L’absorption de NR dépend de la capacité des cellules à maintenir les gradients de pH. Le gradient de protons à l’intérieur des lysosomes maintient un pH inférieur à celui du cytoplasme. À pH physiologique normal, le NR présente une charge nette d’environ zéro, ce qui lui permet de pénétrer dans les membranes cellulaires. Ainsi, le colorant se charge et est retenu à l’intérieur des lysosomes. Par conséquent, plus la quantité de NR retenue est importante, plus le nombre de cellules viables14 est élevé. Les substances chimiques qui endommagent la surface cellulaire ou les membranes lysosomales nuisent à l’absorption de ce colorant.

Le test CFDA-AM est un test de viabilité cellulaire fluorométrique basé sur la rétention de l’ester d’acétoxyméthyle de diacétate de 5-carboxyfluorescéine (CFDA-AM)15. Le 5-CFDA-AM, un substrat d’estérase, est converti en carboxyfluorescéine, une substance fluorescente polaire et non perméable par les membranes des cellules vivantes15 ; Ainsi, il est retenu dans la face interne d’une membrane cellulaire intacte, indiquant des cellules viables.

Récemment, trois essais de cytotoxicité (essais CFDA-AM, NR et AB) ont été combinés dans une ligne directrice validée ISO (Organisation internationale de normalisation) (ISO 21115:2019)16 et une méthode d’essai de l’OCDE (OCDE TG 249) pour évaluer la toxicité aiguë des poissons à l’aide de la lignée cellulaire RTgill-W1 (lignée cellulaire permanente de truite arc-en-ciel [Oncorhynchus mykiss] branchie) dans des plaques à 24 puits17 . Bien qu’il existe une méthode cellulaire pour prédire la toxicité aiguë des poissons, des efforts ont été investis dans le développement de méthodes similaires avec d’autres espèces de poissons et l’augmentation du débit de la méthode. Quelques exemples incluent le développement de lignées cellulaires ZFL transfectées avec des gènes rapporteurs pour des voies de toxicité spécifiques18,19, des tests de phototoxicité dans la lignée cellulaire RTgill-W1 20 et l’utilisation de lignées cellulaires ZFL et ZF4 (poisson zèbre fibroblastique dérivé d’embryons âgés de 1 jour) pour évaluer la toxicité par plusieurs tests de cytotoxicité21.

Danio rerio (poisson zèbre) est l’une des principales espèces de poissons utilisées dans les études de toxicité aquatique; Ainsi, les méthodes cellulaires avec des lignées cellulaires de poisson zèbre pour les tests de toxicité des poissons peuvent être extrêmement utiles. La lignée cellulaire ZFL est une lignée cellulaire hépatocytes épithéliales de poisson zèbre qui présente les principales caractéristiques des cellules parenchymateuses du foie et peut métaboliser les xénobiotiques 7,22,23,24,25. Pendant ce temps, la lignée cellulaire ZEM2S est une lignée cellulaire fibroblastique embryonnaire de poisson zèbre dérivée du stade blastula qui peut être utilisée pour étudier les effets sur le développement des poissons26,27. Ainsi, ce protocole décrit quatre tests de cytotoxicité (tests MTT, AB, NR et CFDA-AM), avec des modifications à effectuer avec des lignées cellulaires ZFL et ZEM2S dans des plaques à 96 puits.

Protocol

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour la liste des matériaux utilisés dans ce protocole et le tableau 1 pour la composition des solutions et des milieux utilisés dans ce protocole. 1. Préparation des cellules ZFL et ZEM2S Commencer avec une fiole T75 de cellules ZFL ou ZEM2S avec 80% de confluence, cultivée dans le milieu complet respectif à 28 °C sans CO2. Retirer le milieu de culture de la fiole…

Representative Results

La figure 3 montre les plaques des tests AB, CFDA-AM, NR et MTT. Pour le test AB (figure 3A), les puits blancs et les puits sans cellules viables ou avec un nombre réduit de cellules viables présentent une couleur bleue et une faible fluorescence, tandis que les puits avec un nombre élevé de cellules viables sont rosâtres et présentent des valeurs de fluorescence élevées en raison de la transformation de la résazurine (AB) en résorunine (substance ros?…

Discussion

Les essais de cytotoxicité sont largement utilisés pour l’évaluation de la toxicité in vitro, et cet article de protocole présente quatre tests de cytotoxicité couramment utilisés modifiés pour être effectués dans des lignées cellulaires de poisson zèbre (c.-à-d. densité cellulaire pour la plaque de 96 puits, temps d’incubation dans le test MTT, déplétion FBS pendant les conditions d’exposition chimique et concentration maximale acceptable pour le SC). Comme ces tests quantifient la cytotox…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

En mémoire du Dr Márcio Lorencini, coauteur de cet ouvrage, excellent chercheur dans le domaine des cosmétiques et dévoué à la promotion de la recherche cosmétique au Brésil. Les auteurs remercient le Laboratoire multi-utilisateurs du Département de physiologie (UFPR) pour la disponibilité des équipements et le soutien financier de la Coordination pour l’amélioration du personnel de l’enseignement supérieur (CAPES, Brésil) (Code financier 001) et du Grupo Boticario.

Materials

5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) Invitrogen C1345
Cell culture plate, 96 well plate Sarstedt 83.3924 Surface: Standard, flat base
DMEM Gibco 12800-017 Powder, high glucose, pyruvate
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026 Powder
HEPES (1 M) Gibco 15630080
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 41300021 Powder
Neutral red  Sigma-Aldrich N4638 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Resazurin sodium salt  Sigma-Aldrich R7017 Powder, BioReagent, suitable for cell culture
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014 Powder
SFB – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder,  bioreagent for molecular biology
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide  98% Sigma-Aldrich M2128
Trypan blue stain (0.4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
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Keywords: Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesZEM2SZFL96-well PlateCell ViabilityAcute ToxicityEcotoxicityAlternative Fish AssaysHepatocytesEmbryonic CellsCell SuspensionMulti-channel PipetteTest ChemicalsTriton X-100Exposure Media
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Rodrigues de Souza, I., Wilke Sivek, T., Vaz de Oliveira, J. B., Di Pietro Micali Canavez, A., de Albuquerque Vita, N., Cigaran Schuck, D., Rodrigues de Souza, I., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64860, doi:10.3791/64860 (2023).
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