이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주의 세포독성 평가에 적합한 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(Alamar Blue[AB], CFDA-AM, Neutral Red 및 MTT 분석)을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
어류 세포주는 생태 독성 연구에 점점 더 많이 사용되고 있으며, 어류 급성 독성을 예측하는 방법으로 세포 독성 분석이 제안되었습니다. 따라서 이 프로토콜은 96웰 플레이트에서 제브라피쉬(Danio rerio) 배아(ZEM2S) 및 간(ZFL) 세포주에서 세포 생존율을 평가하기 위해 수정된 세포독성 분석을 제시합니다. 평가된 세포독성 종점은 미토콘드리아 완전성(Alamar Blue[AB] 및 MTT 분석), 에스테라아제 활성을 통한 막 완전성(CFDA-AM 분석) 및 리소좀 막 완전성(Neutral Red[NR] 분석)입니다. 96-웰 플레이트에서 시험 물질을 노출시킨 후, 세포독성 분석이 수행되고; 여기서, AB 및 CFDA-AM은 동시에 수행되고, 동일한 플레이트에서 NR이 수행되고, MTT 분석은 별도의 플레이트에서 수행된다. 이러한 분석에 대한 판독값은 AB 및 CFDA-AM에 대한 형광과 MTT 및 NR에 대한 흡광도로 측정됩니다. 이러한 어류 세포주로 수행된 세포독성 분석은 어류에 대한 화학 물질의 급성 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
화학 물질은 인체 건강 및 환경에 대한 안전성에 대해 테스트해야합니다. 분자 및 세포 바이오마커는 생체 내 부작용(예: 내분비 교란, 면역학적 반응, 급성 독성, 광독성)3,4,5,6,7 에 선행할 수 있기 때문에 규제 기관 및/또는 법률(예: REACH, OECD, US EPA)에 의해 살아있는 유기체에 대한 영향을 예측하기 위한 안전성 평가에서 점점 더 많이 고려되고 있습니다 . 이러한 맥락에서, 세포 독성은 어류 급성 독성을 예측하기위한 측정으로 취해졌다 5,8; 그러나 어류에 대한 가장 다양한 영향 (예 : 내분비 교란 효과)을 연구하기 위해 화학 물질의 아 세포 독성 농도를 정의하는 것과 같은 생태 독성 연구에서 많은 다른 응용 프로그램을 가질 수 있....
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프로토콜
참고: 이 프로토콜에 사용된 재료 목록은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에 사용된 용액 및 매체의 구성은 표 1 을 참조하십시오.
1. ZFL 및 ZEM2S 세포 준비
- 80% 합류도를 갖는 ZFL 또는 ZEM2S 세포의 T75 플라스크로 시작하여,CO2 없이 28°C에서 각각의 완전한 배지에서 배양하였다.
- 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 10mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(0.01M)를 첨가하여 세포를 세척합니다. 3mL의 1x 트립신(0.05% v/v, 0.5mM 트립신-EDTA)을 배양 플라스크에 추가합니다. 28°C에서 3분 동안 배양합니다.
- 플라스크를 가볍게 두드려 세포를 방출한 다음 플라스크에 완전한 배양 배지 3mL를 추가하여 트립신 소화를 중지합니다.
- 세포 현탁액을 15mL 원추형 원심분리 튜브로 옮기고 100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 ZFL 또는 ZEM2S 세포용 완전 배지 1mL를 추가하고 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.
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결과
그림 3은 AB, CFDA-AM, NR 및 MTT 분석의 플레이트를 보여줍니다. AB 분석(그림 3A)의 경우, 생존 세포가 없거나 감소된 블랭크 웰 및 웰은 청색과 낮은 형광을 나타내는 반면, 생존 세포 수가 많은 웰은 분홍빛을 띠고 생존 세포에 의해 레사주린(AB)이 레소루핀(분홍빛이 도는 물질)으로 변환되어 높은 형광 값을 나타냅니다. CFDA-AM 분석의 경우 플레이트의 웰 색상에 눈에 띄는 차이가 없습니다. 그러나 형광은 CFDA-AM의 보유 및 후속 카르복시플루오레세인(형광 물질)으로의 전환으로 인해 생존 가능한 세포를 포함하는 웰에서 더 높습니다.
NR 분석(그림 3B)의 경우, NR 염료를 보유할 세포가 없기 때문에 블랭크 웰은 매우 낮은 흡광도 값으로 투명해야 합니다. 일부 경우에, 블랭크 웰은 투명하지 .......
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토론
세포독성 분석은 시험관 내 독성 평가에 널리 사용되며, 이 프로토콜 기사에서는 제브라피쉬 세포주에서 수행되도록 변형된 4가지 일반적으로 사용되는 세포독성 분석(즉, 96웰 플레이트의 세포 밀도, MTT 분석의 배양 시간, 화학 노출 조건 동안의 FBS 고갈 및 SC에 대한 최대 허용 농도)을 제시합니다. 이러한 분석은 다양한 세포 생존 종점(대사 기능, 리소좀 막 무결성 및 세포막 무결성)에 의해 세포 독성을 정량화하기 때문에 이들의 조합은 제브라피쉬 세포주에서 화학적 세포 독성의 정확한 평가를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 pH를 7.4(생리학적 pH)로 유지하면서 배양 시스템을 적절하게 완충할 수 있는 배양 배지 구성으로 인해 CO2가 없는 조건에서 ZFL 및ZEM2S 세포주를 배양할 것을 권장합니다. 두 세포주 모두에 대해 이러한 프로토콜에서 제안된 배양 배지 조성 및CO2 무함유 환경은 문헌에 널리 보고되어 있다. ZFL 세포주는 일반적으로 중탄산나트륨을 첨가하거나.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구의 공동 저자 인 Márcio Lorencini 박사를 기리기 위해 화장품 분야의 우수한 연구원이자 브라질에서 화장품 연구를 촉진하는 데 전념했습니다. 저자는 장비 가용성에 대한 생리학과 (UFPR)의 다중 사용자 실험실과 고등 교육 인력 개선 조정 (CAPES, 브라질) (재정 코드 001) 및 Grupo Boticario의 재정 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, 적격, USDA 승인 지역 | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 영양 혼합물, 파우더 | Gibco | 21700026 | 파우더 |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz의 L-15 Medium | Gibco | 41300021 | 파우더 |
| 중립 빨강 | Sigma-Aldrich | N4638 | 분말, BioReagent, 세포 배양 |
| Orbital shaker에 적합 | 가장 따뜻한 | KLD-350-BI | 22 mm 회전 직경 |
| Dulbeccos PBS (10X) 칼슘과 마그네슘 | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin 나트륨 염 | Sigma-Aldrich | R7017 | 분말, 생물 시약, 세포 배양에 적합 |
| RPMI 1640 매체 | Gibco | 31800-014 | 분말 |
| 중탄산나트륨 | Sigma-Aldrich | S5761 | 분말, 분자 생물학용 생물 시약 |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| 트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드 | 없음 Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S 세포주 | ATCC | CRL-2147 | 이 세포주는 Michael J. Carvan 교수(미국 밀워키 위스콘신 대학교) |
| ZFL 세포주 | BCRJ | 256 |
참고문헌
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from:
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재인쇄 및 허가
