مراقبة كعب 1 بوساطة Pexophagy
Summary
يوفر هذا البروتوكول تعليمات لتحفيز ومراقبة الكسوفاجي بوساطة Stub1 في الخلايا الحية.
Abstract
يمكن لخلايا الثدييات أن تقلب البيروكسيسومات من خلال البكسوفاجي بوساطة Stub1. من المحتمل أن يسمح المسار بالتحكم الخلوي في كمية ونوعية البيروكسيسومات. خلال هذه العملية ، ينتقل بروتين الصدمة الحرارية 70 و ubiquitin E3 ligase ، Stub1 ، إلى البيروكسيسومات ليتم قلبها لبدء pexophagy. يسمح نشاط Stub1 ligase بتراكم يوبيكويتين والوحدات الأخرى المتعلقة بالالتهام الذاتي على البيروكسيسومات المستهدفة. يمكن أن يؤدي رفع مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) داخل تجويف البيروكسيسومال إلى تنشيط pexophagy بوساطة Stub1. لذلك ، يمكن للمرء استخدام توليد ROS بمساعدة الصبغة لتشغيل هذا المسار ومراقبته. توضح هذه المقالة إجراءات استخدام فئتين من الأصباغ ، البروتينات الفلورية والفلوروفورات الاصطناعية ، لبدء pexophagy داخل مزارع خلايا الثدييات. لا يمكن استخدام هذه البروتوكولات القائمة على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة لاستهداف جميع البيروكسيسومات داخل مجموعة الخلايا على مستوى العالم فحسب ، بل يمكن أن تسمح أيضا بمعالجة البيروكسيسومات الفردية داخل الخلايا المفردة. نصف أيضا كيف يمكن متابعة pexophagy بوساطة Stub1 باستخدام مجهر الخلايا الحية.
Introduction
البيروكسيسومات عضيات أحادية الغشاء موجودة في معظم الخلايا الحقيقية النواة. البيروكسيسومات هي حجرة استقلابية ضرورية لتنفيذ أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة ، وهدم البيورين ، وتخليق فوسفوليبيد الأثيروحمض الصفراء 1. يتحكم الأسيتيل CoA المشتق من البيروكسيسوم في توازن الدهون عن طريق تنظيم الإشارات المركزية في التمثيل الغذائي2. لذلك ، ليس من المستغرب أن وظائف البيروكسيسومال المعرضة للخطر متضمنة في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والشيخوخة والسرطانات والسمنة والسكري3،4،5. عملية أساسية في الحفاظ على عملية peroxisomal هي pexophagy. Pexophagy هي عملية تقويضية للدوران الانتقائي للبيروكسيسومات عن طريق الالتهام الذاتي. تستخدم الخلايا pexophagy للمساعدة في التحكم في كمية ونوعية البيروكسيسومات ، وبالتالي ضمان وظيفة بيروكسيسومال المناسبة. أظهرت دراسة حديثة أن فقدان البيروكسيسوم الناجم عن الطفرات في عوامل التكوين الحيوي البيروكسيسومالي PEX1 1 و 6 ينتج عن pexophagy6 غير المنضبط. والجدير بالذكر أن 65٪ من جميع مرضى اضطراب التكوين الحيوي البيروكسيسوم (PBD) يعانون من نقص في مركب ATPase AAA البيروكسيسومالي ، المكون من PEX1 و PEX6 و PEX26 في خلايا الثدييات7.
يمكن استخدام عدد من الطرق لبدء ودراسة pexophagy. في الخميرة ، يتم تشغيل pexophagy عندما يتم تحويل العناصر الغذائية الموردة من مصادر الكربون المعتمدة على البيروكسيسوم إلى مصادر الكربون المستقلة عن البيروكسيسوم (لخفض أعداد البيروكسيسوم الخلوية)8. على سبيل المثال ، يؤدي نقل خلايا Pichia pastoris المزروعة بالميثانول من وسط الميثانول إلى وسط الجلوكوز ووسط الإيثانول إلى تحفيز micropexophagy و macropexophagy ، على التوالي8،9،10. قامت عوازل micropexophagy بتجميع البيروكسيسومات للتحلل عن طريق إعادة تشكيل الفجوة لتشكيل أغشية عزل فراغية تشبه الكوب وهيكل يشبه الغطاء يسمى جهاز الغشاء الخاص بالميكروبيكسوفاجي (MIPA). في macropexophagy ، يتم غمر البيروكسيسومات الفردية بواسطة هياكل غشاء مزدوج تعرف باسم pexophagosomes ، تليها الانصهار مع الفجوة للتحلل8،9،10. تعد فسفرة مستقبلات pexophagy ، مثل Atg36p في Saccharomyces cerevisiae و Atg30p في Pichia pastoris ، أمرا بالغ الأهمية للمستقبلات لتوظيف آلات الالتهام الذاتي الأساسية وتسهيل استهداف البيروكسيسومال للجسيمات الذاتية 8,11.
في خلايا الثدييات ، يمكن أن يحدث pexophagy عن طريق الوجود في كل مكان. وضع علامات على بروتينات الغشاء البيروكسيسومالي PMP34 أو PEX3 مع يوبيكويتين على الجانب الخلوي يحفز pexophagy12. يؤدي الإفراط في التعبير عن PEX3 إلى انتشار البيروكسيسوم في كل مكان والتخلص من البيروكسيسوم بواسطة الجسيمات الحالة13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اندماج PEX5 مع EGFP الطرفي C يضعف تصدير PEX5 أحادي الكل وينتج عنه pexophagy14. من ناحية أخرى ، يمكن أيضا تشغيل pexophagy عن طريق علاج H 2 O2. تنتج البيروكسيسومات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ؛ على وجه التحديد ، لا ينتج إنزيم بيروكسيسومال Acox1 ، الذي يحفز الخطوة الأولى من أكسدة بيتا للأحماض الدهنية طويلة السلسلة (> 22 كربون) ، ليس فقط أسيتيل-CoA ولكن أيضا بيروكسيسومال ROS. استجابة لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية المرتفعة تحت علاج H 2O2 ، تقوم خلايا الثدييات بتنشيط pexophagy لخفض إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية وتخفيف التوتر. تم الإبلاغ عن أن علاج H 2O2 يدفع تجنيد الرنح وتوسع الشعيرات المتحور (ATM) إلى البيروكسيسومات. ثم يقوم ATM بفسفرة PEX5 لتعزيز دوران البيروكسيسومال بواسطة pexophagy15.
نظرا لأن البيروكسيسومات هي مراكز مولدة لأنواع الأكسجين التفاعلية ، فهي أيضا عرضة لتلف أنواع الأكسجين التفاعلية. تجبر إصابات البيروكسيسومال المستحثة ب ROS الخلايا على تنشيط pexophagy لبدء مسارات مراقبة جودة البيروكسيسوم (إزالة البيروكسيسوم التالف عن طريق الالتهام الذاتي). هنا ، نحدد نهجا للتسبب عند الطلب لإصابة بيروكسيسومال المستحثة ب ROS. يستفيد البروتوكول من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المنشطة بالضوء داخل العضيات16،17،18،19،20 (الشكل 1). يتم إضاءة البيروكسيسومات ذات العلامات الصبغية ، مما يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية داخل تجويف البيروكسيسومال ، والذي يؤدي على وجه التحديد إلى إصابة البيروكسيسومالي. باستخدام هذا البروتوكول ، تبين أن البيروكسيسومات المجهدة ب ROS تتم إزالتها من خلال مسار تحلل يعتمد على يوبيكوتين. تقوم البيروكسيسومات المجهدة ب ROS بتجنيد ubiquitin E3 ligase Stub1 للسماح بابتلاعها في البلعمة الذاتية لإزالتها الفردية بواسطة pexophagy16. يمكن للمرء استخدام هذا البروتوكول لمقارنة مصير البيروكسيسومات المصابة والصحية داخل نفس الخلية عن طريق الفحص المجهري بفاصل زمني. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإتلاف جميع البيروكسيسومات (في جميع الخلايا) على طبق الاستزراع عالميا ، مما يسمح بالتحليل الكيميائي الحيوي لمسار pexophagy.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذا البروتوكول كيفية تشغيل pexophagy بوساطة Stub1 داخل مزارع الخلايا عن طريق رفع مستويات ROS البيروكسيسومال بالضوء. نظرا لأن البروتوكول يعتمد على توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بمساعدة الصبغة ، يحتاج المرء إلى ضمان التعبير الكافي عن diKillerRed-VKSKL أو تلطيخ ليجند SLP المسمى بالصبغة داخل الخلايا مح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منحة بحثية MOST 111-2311-B-001-019-MY3 من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا في تايوان.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -. C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
