Monitoring Stub1-gemedieerde Pexofagie
Summary
Dit protocol geeft instructies voor het activeren en monitoren van Stub1-gemedieerde pexofagie in levende cellen.
Abstract
Zoogdiercellen kunnen peroxisomen omkeren via Stub1-gemedieerde pexofagie. De route maakt mogelijk cellulaire controle van de kwantiteit en kwaliteit van peroxisomen mogelijk. Tijdens dit proces transloceren heat shock protein 70 en het ubiquitine E3 ligase, Stub1, op peroxisomen om te worden omgedraaid om pexofagie te initiëren. De Stub1 ligase-activiteit maakt de accumulatie van ubiquitine en andere autofagie-gerelateerde modules op gerichte peroxisomen mogelijk. Het verhogen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus binnen het peroxisomale lumen kan Stub1-gemedieerde pexofagie activeren. Men kan daarom kleurstof-ondersteunde ROS-generatie gebruiken om deze route te activeren en te monitoren. Dit artikel schetst de procedures voor het gebruik van twee klassen kleurstoffen, fluorescerende eiwitten en synthetische fluoroforen, om pexofagie in zoogdiercelculturen te initiëren. Deze op kleurstof ondersteunde ROS-generatie gebaseerde protocollen kunnen niet alleen worden gebruikt om alle peroxisomen binnen een celpopulatie wereldwijd aan te pakken, maar kunnen ook de manipulatie van individuele peroxisomen binnen afzonderlijke cellen mogelijk maken. We beschrijven ook hoe Stub1-gemedieerde pexofagie kan worden gevolgd met behulp van live-cell microscopie.
Introduction
Peroxisomen zijn enkelmembraangebonden organellen die aanwezig zijn in de meeste eukaryote cellen. Peroxisomen zijn een metabolisch compartiment dat essentieel is voor het uitvoeren van de bèta-oxidatie van vetzuren met een zeer lange keten, purinekatabolisme en etherfosfolipide- en galzuursynthese1. Peroxisoom-afgeleid acetyl-CoA regelt lipidehomeostase door de centrale signalering in metabolisme2 te reguleren. Daarom is het geen verrassing dat gecompromitteerde peroxisomale functies worden geïmpliceerd in verschillende ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, veroudering, kanker, obesitas en diabetes 3,4,5. Een essentieel proces bij het handhaven van peroxisomale werking is pexofagie. Pexofagie is een katabolisch proces voor de selectieve omzetting van peroxisomen door autofagie. Cellen gebruiken pexofagie om de kwantiteit en kwaliteit van peroxisomen te helpen beheersen, waardoor een goede peroxisomale functie wordt gegarandeerd. Een recente studie toonde aan dat peroxisoomverlies veroorzaakt door mutaties in PEX1 peroxisomale biogenese factoren 1 en 6 het gevolg is van ongecontroleerde pexofagie6. Met name 65% van alle patiënten met peroxisoombiogenesestoornis (PBD) heeft tekortkomingen in het peroxisomale AAA ATPase-complex, bestaande uit PEX1, PEX6 en PEX26 in zoogdiercellen7.
Een aantal methoden kan worden gebruikt om pexofagie te initiëren en te bestuderen. In gist wordt pexofagie geactiveerd wanneer de geleverde voedingsstoffen worden overgeschakeld van peroxisoomafhankelijke koolstofbronnen naar peroxisoomonafhankelijke koolstofbronnen (naar lagere cellulaire peroxisoomaantallen)8. De overdracht van methanol-gekweekte Pichia pastoris-cellen van methanolmedium naar glucosemedium en ethanolmedium induceert bijvoorbeeld micropexofagie en macropexofagie, respectievelijk 8,9,10. Micropexofagie-sequesters clusterden peroxisomen voor afbraak door de vacuole te hermodelleren om cup-achtige vacuolaire sekwestratiemembranen en een dekselachtige structuur te vormen die het micropexofagie-specifieke membraanapparaat (MIPA) wordt genoemd. Bij macropexofagie worden individuele peroxisomen overspoeld door dubbelmembraanstructuren die bekend staan als pexofagosomen, gevolgd door fusie met de vacuole voor afbraak 8,9,10. De fosforylering van pexofagiereceptoren, zoals Atg36p in Saccharomyces cerevisiae en Atg30p in Pichia pastoris, is van cruciaal belang voor de receptoren om kernautofagiemachines te rekruteren en om peroxisomale targeting op autofagosomen 8,11 te vergemakkelijken.
In zoogdiercellen kan pexofagie worden geïnduceerd door ubiquitinatie. Het labelen van de peroxisomale membraaneiwitten PMP34 of PEX3 met ubiquitine aan de cytosolische kant induceert pexofagie12. De overexpressie van PEX3 induceert peroxisoom ubiquitinatie en peroxisoom eliminatie door lysosomen13. Bovendien schaadt de fusie van PEX5 met een C-terminale EGFP de export van monoubiquitinated PEX5 en resulteert in pexofagie14. Aan de andere kant kan pexofagie ook worden veroorzaakt door H 2 O2-behandeling. Peroxisomen produceren reactieve zuurstofsoorten (ROS); specifiek produceert het peroxisomale enzym Acox1, dat de eerste stap van bèta-oxidatie van zeer lange keten vetzuren (> 22 koolstof) katalyseert, niet alleen acetyl-CoA, maar ook peroxisomale ROS. Als reactie op de verhoogde ROS-niveaus onder H 2 O2-behandelingactiveren zoogdiercellen pexofagie om de ROS-productie te verlagen en stress te verlichten. Er is gemeld dat H 2 O2-behandelingde rekrutering van ataxie-teleangiëctasieën gemuteerd (ATM) naar peroxisomen stimuleert. ATM fosforyleert vervolgens PEX5 om de peroxisomale omzet te bevorderen door pexofagie15.
Omdat peroxisomen ROS-genererende centra zijn, zijn ze ook gevoelig voor ROS-schade. ROS-uitgelokte peroxisomale letsels dwingen cellen om pexofagie te activeren om peroxisoomkwaliteitscontroleroutes te initiëren (verwijdering van het beschadigde peroxisoom door autofagie). Hier schetsen we een aanpak voor het on-demand triggeren van ROS-uitgelokt peroxisomale schade. Het protocol maakt gebruik van lichtgeactiveerde ROS-productie binnen organellen 16,17,18,19,20 (figuur 1). Peroxisomen met kleurstoflabel worden verlicht, wat leidt tot ROS-productie in het peroxisomale lumen, wat specifiek peroxisomale schade veroorzaakt. Met behulp van dit protocol wordt aangetoond dat ROS-gestresste peroxisomen worden verwijderd via een ubiquitine-afhankelijke afbraakroute. ROS-gestreste peroxisomen rekruteren het ubiquitine E3-ligase Stub1 om hun overspoeling in autofagosomen mogelijk te maken voor individuele verwijdering door pexofagie16. Men kan dit protocol gebruiken om het lot van gewonde en gezonde peroxisomen in dezelfde cel te vergelijken door middel van time-lapse microscopie. De methode kan ook worden gebruikt om alle peroxisomen (in alle cellen) op een kweekschaal globaal te beschadigen, waardoor de biochemische analyse van de pexofagieroute mogelijk is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft hoe Stub1-gemedieerde pexofagie in celculturen kan worden geactiveerd door peroxisomale ROS-niveaus met licht te verhogen. Omdat het protocol afhankelijk is van kleurstof-geassisteerde ROS-generatie, moet men zorgen voor voldoende expressie van diKillerRed-VKSKL of kleurstof-gelabelde SLP-ligandkleuring in de cellen van belang. Gezien het feit dat verschillende celtypen of cellen met verschillende genetische achtergronden peroxisomen met enigszins verschillende eigenschappen kunnen bevatten, moet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een MOST 111-2311-B-001-019-MY3 onderzoeksbeurs van de National Science and Technology Council in Taiwan.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
References
- Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83 (2016).
- He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
- Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
- Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, 45-65 (2013).
- Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
- Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
- Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
- Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
- Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -. C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
- Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721 (2012).
- Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578 (2020).
- Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
- Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
- Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
- Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
- Chen, B. -. H., Chang, Y. -. J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345 (2021).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428 (2013).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
- Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
- Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).
