مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لتتبع الشق / الالتقام الخلوي دلتا أثناء التقسيم غير المتماثل لأسلاف الدبقية الكعبرية الزرد
Summary
يطور هذا العمل مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لتصوير إشارات Notch / DeltaD داخل السلالة في تقسيم أسلاف الدبقية الشعاعية لدماغ الزرد الجنيني.
Abstract
يعد الانقسام الخلوي غير المتماثل (ACD) ، الذي ينتج خليتين ابنتين من مصائر مختلفة ، أمرا أساسيا لتوليد التنوع الخلوي. في الأعضاء النامية لكل من اللافقاريات والفقاريات ، يولد السلف المنقسم بشكل غير متماثل الشق عالي التجديد الذاتي وابنة Notchlo المميزة. في دماغ الزرد الجنيني ، تخضع أسلاف الدبقية الكعبرية (RGPs) – الخلايا الجذعية العصبية الفقارية الرئيسية – في الغالب ل ACD لتلد RGP واحد وخلية عصبية متمايزة واحدة. إن الوضوح البصري وسهولة الوصول إلى أجنة الزرد يجعلها مثالية للتصوير بفاصل زمني في الجسم الحي لتصور مباشر كيف ومتى يتم إنشاء عدم تناسق إشارات Notch أثناء ACD. أظهرت الدراسات الحديثة أن التكاثر الخلوي الديناميكي ل Notch ligand DeltaD يلعب دورا مهما في تحديد مصير الخلية أثناء ACD ، ويتم تنظيم العملية بواسطة منظم القطبية المحفوظ تطوريا Par-3 (المعروف أيضا باسم Pard3) ومجمع محرك الداينين. لتصور أنماط الاتجار في الجسم الحي لإندوسومات إشارات Notch في RGPs الانقسامية ، قمنا بتطوير مقايسة امتصاص الأجسام المضادة هذه. باستخدام الفحص ، اكتشفنا ديناميكية الإندوسومات المحتوية على DeltaD أثناء تقسيم RGP.
Introduction
تتحكم إشارات الشق في قرار مصير الخلية ونمطها أثناء التطور في metazoans1 ، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن إشارات Notch في انقسام الخلايا الجذعية تعتمد بشكل أساسي على الاتجار داخل الخلايا 2,3. يمكن ل Endocytosed Notch / Delta تنشيط إشارات Notch في النواة وتعزيز نسخ الجينات المستهدفة من Notch4،5،6. لوحظ الاتجار بالشق الاتجاهي / دلتا endosomal لأول مرة في خلايا سلائف الأعضاء الحسية (SOP) في ذبابة الفاكهة أثناء انقسام الخلايا غير المتماثل (ACD) ، مما أدى إلى نشاط إشارات Notch أعلى في pIIa مقارنة ب pIIb 7,8. تم تطبيق مقايسات امتصاص الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة لدلتا والأجسام المضادة للشق لمراقبة العملية الداخلية في خلايا SOP الانقسامية. تتحرك إندوسومات الشق / دلتا D جنبا إلى جنب مع بروتين محرك كينيسين إلى المغزل المركزي أثناء التحريك الخلوي ، ويتم نقلها بشكل غير متماثل إلى خلية pIIa بسبب المصفوفة المضادة للتوازي للمغزل المركزي غير المتماثل في اللحظة الأخيرة من انقسام الخلية 3,8. ألقت هذه الدراسات الضوء على الآليات الجزيئية التي تنظم الانقسام غير المتماثل في خلايا ذبابة الفاكهة SOP ، ولكن من غير الواضح ما إذا كانت العمليات الداخلية المماثلة تحدث في أسلاف الخلايا الدبقية الشعاعية الفقارية (RGPs).
علاوة على ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تنظم إشارات Notch / DeltaD غير المتماثلة أثناء انقسام RGP للفقاريات ليست مفهومة جيدا. في الزرد ، تم الإبلاغ عن أن تفاعل Notch و Delta يسهل التداخل الخلوي ل DeltaDligand 9. من غير المعروف ما إذا كان التكاثر الخلوي DeltaD يمكن أن يؤثر على اختيار مصير الخلية للخلايا الوليدة في دماغ الفقاريات النامية. تظهر الدراسات الحديثة أن حقن الأجسام المضادة المضادة ل DeltaD المترافقة بالفلورسنت في الأنبوب العصبي يمكن أن يسمي إندوسومات سارة على وجه التحديد في الخلايا الظهارية العصبية ، ومضادات DeltaD التي تحتوي على إندوسومات سارة تنفصل بشكل تفضيلي إلى خلايا ابنة متكاثرة10. وقد اقترح أن إشارات الشق من الإندوسومات يمكن أن تنظم مصير الخلايا الابنة. أظهرت النتائج السابقة أن معظم خلايا RGP لأسماك الزرد في الدماغ الأمامي النامي تخضع ل ACD ، ويعتمد تحديد مصير الخلية الابنة على إشارات Notch / DeltaD داخل السلالة11. من أجل توضيح طبيعة إشارات Notch / DeltaD داخل النسب في RGPs الزرد ، قمنا بتطوير مقايسة امتصاص الأجسام المضادة ل DeltaD في الدماغ النامي لأسماك الزرد. باستخدام هذا البروتوكول ، نجحنا في إجراء وضع العلامات الحية والتصوير لتهريب الخلايا الداخلية DeltaD في RGPs الانقسامية.
يتم استيعاب الجسم المضاد المضاد DeltaD المسمى بالفلورسنت بكفاءة في RGPs على طول البطين الأمامي للدماغ. لقد سهل إلى حد كبير اكتشاف الاتجار الاتجاهي بإندوسومات DeltaD في RGPs المقسمة بشكل غير متماثل12,13. بالمقارنة مع بروتوكولات امتصاص الأجسام المضادة السابقة التي تم تطويرها لمزارع ذبابة الفاكهة والحبل الشوكي الزرد 10 ، حقق هذا البروتوكول علامات طويلة الأمد وعالية الكفاءة لمكافحة DeltaD في طبقة خلايا البطين في الدماغ ، وتحديدا مع أقل من10 nL من خليط الأجسام المضادة المحقونة بالحقن الدقيق. يعد حقن البطين الخلفي في الدماغ مناسبا جدا لتطبيق مقايسة امتصاص الأجسام المضادة في الدماغ النامي ، حيث يتم توسيع البطين الخلفي بشكل جيد في أجنة الزرد ويمتلئ بالسائل النخاعي في مرحلة التطورالمبكرة 14. من خلال حقن خليط الأجسام المضادة في البطين الخلفي للدماغ دون إصابة أي أنسجة نامية مهمة ، قلل البروتوكول من الضرر المحتمل لمنطقة التصوير في الدماغ الأمامي قدر الإمكان. كما تجنبت الجرعة المخفضة للجسم المضاد الأولي المحقون الآثار الجانبية المحتملة للتدخل في إشارات دلتا نوتش الداخلية في الجسم الحي. يمكن دمج هذا البروتوكول بسهولة مع الاضطرابات الدوائية أو الجينية الأخرى ، واستخدامه في مراحل نمو مختلفة ، وربما تكييفه مع الدماغ البالغ وكذلك عضويات الدماغ 2D / 3D المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية. مجتمعة ، جعل البروتوكول من الممكن فهم كيف ومتى يتم إنشاء عدم تناسق إشارات Notch أثناء ACD. يتمثل التحدي الرئيسي للتنفيذ الناجح لهذا البروتوكول في تحقيق التسليم الدقيق للتركيزات المناسبة للجسم المضاد بناء على ظروف تجريبية محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد طورنا مقايسة امتصاص الأجسام المضادة لوضع العلامات والتصوير للاتجار بالشق / دلتا الإندوسومي في أسلاف الدبقية الشعاعية الزرد بكفاءة عالية. مقارنة بالطرق السابقة المستخدمة لتتبع الأجسام المضادة المضادة ل DeltaD في خلايا ذبابة الفاكهةSOP 7,8 ، استخدمت طريقتنا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم المشروع من قبل NIH R01NS120218 ، وجائزة UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed للابتكار ، و Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. . Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daeden, A., Gonzalez-Gaitan, M. Endosomal trafficking during mitosis and notch-dependent asymmetric division. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 57, 301-329 (2018).
- Le Borgne, R., Schweisguth, F. Notch signaling: endocytosis makes delta signal better. Current Biology. 13 (7), 273-275 (2003).
- Chapman, G., et al. Notch1 endocytosis is induced by ligand and is required for signal transduction. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (1), 166-177 (2016).
- Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature. 393 (6683), 382-386 (1998).
- Coumailleau, F., Fürthauer, M., Knoblich, J. A., González-Gaitán, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458 (7241), 1051-1055 (2009).
- Derivery, E., et al. Polarized endosome dynamics by spindle asymmetry during asymmetric cell division. Nature. 528 (7581), 280-285 (2015).
- Matsuda, M., Chitnis, A. B. Interaction with Notch determines endocytosis of specific Delta ligands in zebrafish neural tissue. Development. 136 (2), 197-206 (2009).
- Kressmann, S., Campos, C., Castanon, I., Fürthauer, M., González-Gaitán, M. Directional Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division in the spinal cord. Nature Cell Biology. 17 (3), 333-339 (2015).
- Dong, Z., Yang, N., Yeo, S. -. Y., Chitnis, A., Guo, S. Intralineage directional Notch signaling regulates self-renewal and differentiation of asymmetrically dividing radial glia. Neuron. 74 (1), 65-78 (2012).
- Zhao, X., et al. Polarized endosome dynamics engage cytoplasmic Par-3 that recruits dynein during asymmetric cell division. Science Advances. 7 (24), (2021).
- Zhao, X., Garcia, J., Royer, L. A., Guo, S. Colocalization analysis for cryosectioned and immunostained tissue samples with or without label retention expansion microscopy (LR-ExM) by JACoP. Bio-Protocol. 12 (5), 4336 (2022).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. Journal of Visualized Experiments. (26), e1218 (2009).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Calibration of the injection volume for microinjection of Xenopus oocytes and embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Lukinavičius, G., et al. Fluorogenic probes for multicolor imaging in living cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (30), 9365-9368 (2016).
