Antikörperaufnahme-Assay zur Verfolgung der Notch/Delta-Endozytose während der asymmetrischen Teilung von radialen Zebrafisch-Gliavorläuferzellen

Summary

In dieser Arbeit wird ein Antikörper-Aufnahme-Assay für die Bildgebung des Intra-Lineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in sich teilenden radialen Gliavorläuferzellen des embryonalen Zebrafischgehirns entwickelt.

Abstract

Die asymmetrische Zellteilung (ACD), bei der zwei Tochterzellen mit unterschiedlichem Schicksal entstehen, ist grundlegend für die Erzeugung zellulärer Vielfalt. In den sich entwickelnden Organen sowohl von Wirbellosen als auch von Wirbeltieren erzeugen asymmetrisch sich teilende Vorläuferzellen eine^{sich selbst} erneuernde und eine^{sich differenzierende} Tochter. Im embryonalen Zebrafischgehirn durchlaufen radiale Gliavorläuferzellen (RGPs) – die wichtigsten neuralen Stammzellen von Wirbeltieren – meist eine ACD, um ein RGP und ein differenzierendes Neuron zu gebären. Die optische Klarheit und die leichte Zugänglichkeit von Zebrafischembryonen machen sie ideal für In-vivo-Zeitrafferaufnahmen, um direkt zu visualisieren, wie und wann die Asymmetrie des Notch-Signalwegs während der ACD hergestellt wird. Neuere Studien haben gezeigt, dass die dynamische Endozytose des Notch-Liganden DeltaD eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Zellschicksals während der ACD spielt und durch den evolutionär konservierten Polaritätsregulator Par-3 (auch bekannt als Pard3) und den Dynein-Motorkomplex reguliert wird. Um die in vivo Transportmuster von Notch-Signal-Endosomen in mitotischen RGPs sichtbar zu machen, haben wir diesen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt. Mit Hilfe des Assays haben wir die Dynamik von DeltaD-haltigen Endosomen während der RGP-Teilung aufgedeckt.

Introduction

Der Notch-Signalweg steuert die Entscheidung über das Zellschicksal und die Musterbildung während der Entwicklung in Metazoen¹, und neuere Studien haben gezeigt, dass der Notch-Signalweg bei der Stammzellteilung hauptsächlich vom endozytären Transport abhängt ^2,3. Endozytosiertes Notch/Delta kann den Notch-Signalweg im Zellkern aktivieren und die Transkription der Notch-Zielgene ^4,5,6 verbessern. Directional Notch/Delta endosomaler Transport wurde erstmals in Drosophila-Sinnesorgan-Vorläuferzellen (SOP) während der asymmetrischen Zellteilung (ACD) beobachtet, was zu einer höheren Notch-Signalaktivität in pIIa als in pIIb^{führte 7,8}. Antikörperaufnahme-Assays mit Anti-Delta- und Anti-Notch-Antikörpern wurden eingesetzt, um den endozytären Prozess in mitotischen SOP-Zellen zu überwachen. Notch/DeltaD-Endosomen bewegen sich während der Zytokinese zusammen mit einem Kinesin-Motorprotein zur zentralen Spindel und werden aufgrund der antiparallelen Anordnung der asymmetrischen Zentralspindel im letzten Moment der Zellteilung asymmetrisch in die pIIa-Zelle transloziert ^3,8. Diese Studien haben Aufschluss über die molekularen Mechanismen gegeben, die die asymmetrische Teilung in Drosophila-SOP-Zellen regulieren, aber es ist unklar, ob ähnliche endozytäre Prozesse in radialen Gliavorläuferzellen (RGPs) von Wirbeltieren ablaufen.

Darüber hinaus sind die molekularen Mechanismen, die den asymmetrischen Notch/DeltaD-Signalweg während der RGP-Teilung von Wirbeltieren regulieren, nicht gut verstanden. Im Zebrafisch wurde berichtet, dass die Interaktion von Notch und Delta die Endozytose des DeltaD-Liganden⁹ erleichtert. Es ist nicht bekannt, ob die DeltaD-Endozytose die Wahl des Zellschicksals von Tochterzellen im sich entwickelnden Wirbeltiergehirn beeinflussen kann. Neuere Studien zeigen, dass die Injektion fluoreszenzkonjugierter Anti-DeltaD-Antikörper in das Neuralrohr Sara-Endosomen spezifisch in Neuroepithelzellen markieren könnte, und Anti-DeltaD-haltige Sara-Endosomen segregieren bevorzugt in proliferierende Tochterzellen¹⁰. Es wurde vermutet, dass der Notch-Signalweg von den Endosomen das Schicksal der Tochterzellen regulieren könnte. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass die meisten RGP-Zellen des Zebrafisches im sich entwickelnden Vorderhirn einer ACD unterziehen, und die Bestimmung des Schicksals der Tochterzellen hängt von der intralinearen Notch/DeltaD-Signaltransduktion^{ab 11}. Um die Natur des Intralineage-Notch/DeltaD-Signalwegs in Zebrafisch-RGPs aufzuklären, haben wir den Anti-DeltaD-Antikörper-Aufnahme-Assay im sich entwickelnden Gehirn von Zebrafischen entwickelt. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich Live-Markierungen und Bildgebungen des endozytären DeltaD-Transports in mitotischen RGPs durchgeführt.

Der fluoreszenzmarkierte Anti-DeltaD-Antikörper wird entlang des Vorderhirnventrikels effizient in die RGPs internalisiert. Es hat die Entdeckung des gerichteten Transports von DeltaD-Endosomen in den asymmetrisch teilenden RGPs erheblich erleichtert^12,13. Im Vergleich zu früheren Antikörperaufnahmeprotokollen, die für Drosophila notum-Kulturen und das Rückenmark des Zebrafisches entwickelt wurden 10, hat dieses Protokoll eine lang anhaltende und hocheffiziente Anti-DeltaD-Markierung in der Zellschicht des Hirnventrikels erreicht, insbesondere mit weniger als¹⁰ nL mikroinjizierter Antikörpermischung. Die Injektion des Hinterhirnventrikels ist sehr praktisch für die Anwendung des Antikörperaufnahmetests im sich entwickelnden Gehirn, da der Hinterhirnventrikel in Zebrafischembryonen gut erweitert und im frühen Entwicklungsstadium mit Liquor cerebrospinalis gefüllt ist¹⁴. Durch die Injektion des Antikörpergemisches in die Hinterhirnkammer, ohne wichtige sich entwickelnde Gewebe zu verletzen, hat das Protokoll eine mögliche Schädigung der Bildgebungszone im Vorderhirn so weit wie möglich minimiert. Die reduzierte Dosis des injizierten Primärantikörpers hat auch mögliche Nebenwirkungen einer Störung des endogenen Delta-Notch-Signalwegs in vivo vermieden. Dieses Protokoll kann leicht mit anderen pharmakologischen oder genetischen Störungen kombiniert, in verschiedenen Entwicklungsstadien eingesetzt und möglicherweise an das erwachsene Gehirn sowie an aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene 2D/3D-Gehirnorganoide angepasst werden. Zusammenfassend hat das Protokoll es möglich gemacht zu verstehen, wie und wann eine Notch-Signalasymmetrie während der ACD entsteht. Die größte Herausforderung für die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls besteht darin, eine präzise Abgabe geeigneter Konzentrationen des Antikörpers auf der Grundlage spezifischer experimenteller Bedingungen zu erreichen.

Protocol

Für die Studie haben wir die AB-Wildtyp-Linie und die transgene Linie Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] verwendet. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of California, San Francisco, USA genehmigt (Zulassungsnummer: AN179000). 1. Präparation von Zebrafischembryonen Stellen Sie am Nachmittag vor 17:00 Uhr Fischkreuzungsbecken mit einem weiblichen Wildtyp-Fisch und einem männlichen Tg [ef1a:Myr-Tdtomato]…

Representative Results

In Abbildung 2A zeigten die Embryonen, denen Atto647N injiziert wurde, ohne an den primären Antikörper zu binden, eine Hintergrundfluoreszenz im Hirnventrikel. In den Zellen sind nur sehr wenige verschlungene fluoreszierende Partikel zu beobachten. Die anti-Dld-Atto647N injizierten Zebrafischembryonen zeigten große Mengen internalisierter fluoreszierender Partikel in den meisten Zellen des sich entwickelnden Vorderhirns (Abbildung 2A, rechtes Bild). Nach dem …

Discussion

Wir haben einen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt, mit dem der endosomale Notch/Delta-Transport in radialen Gliavorläuferzellen von Zebrafischen mit hoher Effizienz markiert und abgebildet werden kann. Im Vergleich zu früheren Methoden, die zur Verfolgung markierter Anti-DeltaD-Antikörper in Drosophila-SOP-Zellen^{verwendet wurden 7,8,} verwendete unsere Methode die Mikroinjektion anstelle der Inkubation von Proben im konjugierten Antikörper. Fluoreszenzkonj…

Materials

35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050