Dette arbeidet utvikler en antistoffopptaksanalyse for avbildning av intra-lineage Notch / DeltaD-signalering ved deling av radiale glia-forfedre til den embryonale sebrafiskhjernen.
Asymmetrisk celledeling (ACD), som produserer to datterceller med forskjellige skjebner, er grunnleggende for å generere cellulært mangfold. I utviklingsorganene til både virvelløse dyr og virveldyr genererer asymmetrisk delende forfedre en Notchhi selvfornyelse og en Notchlo differensierende datter. I den embryonale sebrafiskhjernen gjennomgår radiale glia-forfedre (RP) – de viktigste virveldyrnevrale stamceller – for det meste ACD for å føde en RGP og en differensierende nevron. Den optiske klarheten og den enkle tilgjengeligheten til sebrafiskembryoer gjør dem ideelle for in vivo time-lapse-avbildning for direkte å visualisere hvordan og når asymmetrien til Notch-signalering etableres under ACD. Nylige studier har vist at dynamisk endocytose av Notch-liganden DeltaD spiller en avgjørende rolle i celleskjebnebestemmelse under ACD, og prosessen reguleres av den evolusjonært konserverte polaritetsregulatoren Par-3 (også kjent som Pard3) og dyneinmotorkomplekset. For å visualisere in vivo trafikkmønstre av Notch-signalendosomer i mitotiske RP-er, har vi utviklet denne antistoffopptaksanalysen. Ved hjelp av analysen har vi avdekket dynamikken til DeltaD-holdige endosomer under RGP-deling.
Notch-signalering styrer celleskjebneavgjørelse og mønster under utvikling i metazoans1, og nyere studier har vist at Notch-signalering i stamcelledeling hovedsakelig avhenger av endocytisk handel 2,3. Endocytosed Notch/Delta kan aktivere Notch-signalering i kjernen og forbedre transkripsjonen av Notch-målgener 4,5,6. Directional Notch/Delta endosomal trafficking ble først observert i Drosophila sensory organ precursor (SOP) celler under sin asymmetriske celledeling (ACD), noe som resulterte i en høyere Notch signaleringsaktivitet i pIIa enn i pIIb 7,8. Antistoffopptaksanalyser med anti-Delta og anti-Notch antistoffer har blitt brukt for å overvåke endocytisk prosess i mitotiske SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer beveger seg sammen med et kinesinmotorprotein til den sentrale spindelen under cytokinese, og blir asymmetrisk translokalisert til pIIa-cellen på grunn av den antiparallelle matrisen til den asymmetriske sentrale spindelen i siste øyeblikk av celledeling 3,8. Disse studiene har kastet lys over de molekylære mekanismene som regulerer asymmetrisk deling i Drosophila SOP-celler, men det er uklart om lignende endocytiske prosesser forekommer hos virveldyr radiale gliaprogenitorer (RP).
Videre er de molekylære mekanismene som regulerer asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under vertebrate RGP-divisjon ikke godt forstått. I sebrafisk har det blitt rapportert at samspillet mellom Notch og Delta letter endocytosen av DeltaD-liganden9. Det er ukjent om DeltaD endocytose kan påvirke celleskjebnevalget til datterceller i den utviklende virveldyrhjernen. Nylige studier viser at injeksjon av fluorescerende konjugerte anti-DeltaD-antistoffer i nevrale røret kan merke Sara-endosomer spesifikt i nevroepitelceller, og anti-DeltaD som inneholder Sara-endosomer fortrinnsvis segregerer til prolifererende datterceller10. Det har blitt foreslått at Notch-signalering fra endosomene kunne regulere dattercelleskjebnen. Tidligere resultater har vist at de fleste sebrafisk RGP-celler i den utviklende forhjernen gjennomgår ACD, og dattercelleskjebnebestemmelsen er avhengig av intralineage Notch/DeltaD-signalering11. For å belyse arten av intralineage Notch/DeltaD-signalering hos fastleger for sebrafisk, har vi utviklet anti-DeltaD antistoffopptaksanalysen i den sebrafiskutviklende hjernen. Ved hjelp av denne protokollen har vi med hell utført live merking og avbildning av DeltaD endocytisk handel med mitotiske fastleger.
Det fluorescerende merkede anti-DeltaD-antistoffet internaliseres effektivt i fastlegene langs forhjerneventrikkelen. Det har i stor grad gjort det lettere å oppdage retningsbestemt handel med DeltaD-endosomer i de asymmetrisk delende fastlegene12,13. Sammenlignet med tidligere antistoffopptaksprotokoller utviklet for Drosophila notumkulturer og sebrafiskryggmargen 10, har denne protokollen oppnådd langvarig og svært effektiv anti-DeltaD-merking i hjerneventrikkelcellelaget, spesielt med mindre enn10 nL mikroinjisert antistoffblanding. Bakhjernens ventrikkelinjeksjon er veldig praktisk for påføring av antistoffopptaksanalysen i den utviklende hjernen, da bakhjernens ventrikkel er godt utvidet i sebrafiskembryoer og fylt opp med cerebrospinalvæske i tidlig utviklingsstadium14. Ved å injisere antistoffblandingen i bakhjernens ventrikkel uten å skade noe avgjørende utviklende vev, har protokollen minimert mulig skade på bildesonen i forhjernen så mye som mulig. Den reduserte dosen av det injiserte primære antistoffet har også unngått potensielle bivirkninger ved å forstyrre endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Denne protokollen kan enkelt kombineres med andre farmakologiske eller genetiske forstyrrelser, utnyttes på forskjellige utviklingsstadier, og muligens tilpasses den voksne hjernen så vel som humane pluripotente stamcelleavledede 2D / 3D hjerneorganoider. Samlet sett har protokollen gjort det mulig å forstå hvordan og når Notch-signalasymmetri etableres under ACD. Hovedutfordringen for vellykket implementering av denne protokollen er å oppnå presis levering av passende konsentrasjoner av antistoffet basert på spesifikke eksperimentelle forhold.
Vi har utviklet en antistoffopptaksanalyse for merking og avbildning av endosomal Notch/Delta-handel med sebrafisk radiale glia-forfedre med høy effektivitet. Sammenlignet med tidligere metoder brukt for sporing av merket anti-DeltaD antistoff i Drosophila SOP celler7,8, brukte vår metode mikroinjeksjon i stedet for inkubasjon av prøver i det konjugerte antistoffet. Fluorescerende konjugerte anti-Dld-antistoffer ble mikroinjisert i bakhjernens ventrikkel; Denn…
The authors have nothing to disclose.
Prosjektet ble støttet av NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation og Chan Zuckerberg Biohub.
35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
air pressure injector | Narishige | IM300 | |
Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
KCl | Millipore | 529552 | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |