Summary
本协议描述了一种基于网络药理学预测和代谢组学验证的探索叶藻对抗高脂血症的关键靶点和机制的综合策略。
Abstract
高脂血症已成为全球心血管疾病和肝损伤的主要危险因素。在中医和印度医学理论中，Fructus Phyllanthi（FP）是一种有效的抗高脂血症药物，但其潜在机制有待进一步探索。本研究旨在基于网络药理学预测与代谢组学验证相结合的综合策略，揭示FP对抗高脂血症的机制。通过评估血浆脂质水平，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），建立了高脂肪饮食（HFD）诱导的小鼠模型。应用网络药理学找出FP的有效成分和抗高脂血症的潜在靶点。进行血浆和肝脏代谢组学鉴定正常组、模型组和干预组的差异代谢产物及其对应通路。进一步构建网络药理学与代谢组学的关系，全面了解FP抗高脂血症的过程。通过分子对接验证获得的关键靶蛋白。这些结果表明，FP改善了HFD诱导的高脂血症的血脂水平和肝损伤。没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇在FP中被证明是关键的活性化合物。通过代谢组学发现血浆和肝脏中分别有16种和6种潜在差异代谢物参与FP对高脂血症的治疗效果。此外，整合分析表明，干预效果与CYP1A1、AChE和MGAM以及L-犬尿氨酸、皮质酮、乙酰胆碱和棉子糖的调节有关，主要涉及色氨酸代谢途径。分子对接确保了上述作用于高脂血症相关蛋白靶标的成分在降低脂质中发挥关键作用。综上所述，本研究为防治高脂血症提供了新的可能性。
Introduction
高脂血症是一种常见的代谢性疾病，严重影响人体健康，也是心血管疾病的主要危险因素1。最近，这种疾病出现了与年龄相关的下降趋势，由于长期不规律的生活方式和不健康的饮食习惯，年轻人变得更加易感2。在临床上，各种药物已被用于治疗高脂血症。例如，高脂血症和相关动脉粥样硬化性疾病患者最常用的药物之一是他汀类药物。然而，长期使用他汀类药物具有不容忽视的副作用，导致预后不良，例如不耐受，治疗耐药性和不良事件3，4。这些缺点已成为高脂血症患者的额外痛点。因此，应提出稳定的降脂效果和较少副作用的新疗法。
中医（TCM）因其疗效好、副作用少而被广泛用于治疗疾病5。Fructus Phyllanthi （FP），余甘子林恩的干果。（俗称余甘子或印度醋栗），是中印中药6、7的著名药食同源材料。根据中医理论8，该药已被用于清热，冷却血液和促进消化。现代药理研究表明，FP富含没食子酸、鞣花酸、槲皮素9等生物活性化合物，它们通过作为抗氧化剂、抗炎、护肝、抗降血脂等，具有一系列多方面的生物学特性10。最近的研究也表明，FP可以有效调节高脂血症患者的血脂。例如，Variya等人11已经证明，FP果汁及其主要化学成分没食子酸可以降低血浆胆固醇，减少肝脏和主动脉中的油脂浸润。治疗效果与FP调节增加过氧化物酶体增殖物激活受体α的表达和降低肝质活性有关。然而，FP改善高脂血症的潜在机制有待进一步研究，因为它的生物活性成分相当广泛。我们试图探索FP治疗效果的潜在机制，这可能有利于该药物的进一步开发和利用。
目前，网络药理学被认为是研究中医治疗机制的一种整体有效的技术。构建完整的药物-成分-基因-疾病网络，寻找多成分药物综合治疗的多靶点机制，而不是寻找单一的致病基因和治疗单个靶点的药物12。这种技术特别适用于中医，因为它们的化学成分很大。不幸的是，网络药理学在理论上只能用于预测受化学成分影响的靶点。应观察疾病模型中的内源性代谢物，以验证网络药理学的有效性。随着系统生物学的发展而出现的代谢组学方法是监测内源性代谢物变化的重要工具13。代谢产物的变化反映了宿主的稳态变化，也是研究内部机制的重要指标。一些研究人员成功地整合了网络药理学和代谢组学，探索了药物与疾病之间的相互作用机制14，15。
本文通过整合网络药理学和代谢组学技术，探讨FP对抗高脂血症的机制基础。应用网络药理学分析FP中主要活性成分与高脂血症分子靶点的关系。随后，进行代谢组学观察动物模型中内源性代谢物的变化，这可以解释药物在代谢水平的作用。与单纯应用网络药理学或代谢组学相比，这种综合分析提供了更具体、更全面的研究机制。此外，分子对接策略用于分析活性成分与关键蛋白质之间的相互作用。总的来说，这种综合方法可以弥补网络药理学实验证据的缺乏和代谢组学方法缺乏内源性机制的不足，可用于天然药物的治疗机制分析。该协议的主要原理图流程图如图 1所示。
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Protocol
所有涉及动物处理的程序均按照《成都中医药大学实验动物护理和使用指南》进行，并经成都中医药大学机构伦理委员会批准（协议编号2020-36）。雄性C57BL / 6小鼠（20±2g）用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。
1. 基于网络药理学的预测
注：网络药理学用于预测FP对抗高脂血症的活性成分及其关键靶点。
- 活性成分和关键目标的选择
- 在中药系统药理学数据库（TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php）中搜索关键词“叶藻”，获取FP候选活性成分和靶点列表。
注意：通常，数据库中只有口服生物利用度（OB）≥30%和药物样（DL）值≥0.18的成分才作为活性成分包括在内。 - 在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/），在线孟德尔遗传在人类数据库（OMIM;https://omim.org/）和治疗靶点数据库（TTD;http://db.idrblab.net/ttd/）中搜索关键字“高脂血症”，以获得高脂血症的相应候选靶点。下载疾病目标电子表格。删除重复靶点，获取高脂血症靶点列表。
- 将步骤 1.1.1 和 1.1.2 中的这些列表复制到新的电子表格中。使用工具栏中的“数据 - 识别重复项”功能获取交叉点目标。将交叉目标列表导入UniProtKB （http://www.uniprot.org/），以标准化基因和蛋白质名称。
注意：这些目标与FP和高脂血症有关。因此，预测这些交叉靶点作为FP抗高脂血症的靶标。
- 在中药系统药理学数据库（TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php）中搜索关键词“叶藻”，获取FP候选活性成分和靶点列表。
- 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建
- 打开字符串数据库 （https://string-db.org/） 11.5.将FP抗高脂血症的交叉目标列表粘贴到“名称列表”对话框中。在“生物体”中选择智人 ，然后单击 搜索>继续。
注意：人类和小鼠具有高度相似的基因。因此，用小鼠进行进一步的实验验证。 - 当结果可用时，在“高级设置”中 勾选隐藏网络中断开连接的节点 。在“所需的最低交互分数”中设置 最高置信度 （0.900）， 然后单击“ 更新 ”按钮。
- 单击标题栏中的 导出 ，然后下载 PNG 和 TSV 格式的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络的简短表格文本。
- 打开字符串数据库 （https://string-db.org/） 11.5.将FP抗高脂血症的交叉目标列表粘贴到“名称列表”对话框中。在“生物体”中选择智人 ，然后单击 搜索>继续。
- 构建药物-成分-疾病-靶点网络
- 打开细胞景观3.9.1（见 材料表）。导入步骤 1.2.3 的 TSV 格式文件。通过控制面板中的样式栏优化网络节点的颜色、字体和侧面。
- 使用“分析网络”功能进行网络拓扑分析。通过CytoHubba在Cytoscape中获得枢纽基因。建立药物-成分-靶点-疾病网络。
- GO和KEGG富集分析
- 打开大卫生物信息学资源（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）。单击“开始分析 ”并将目标列表粘贴到左侧对话框中。在“选择标识符”中选择 官方基因符号 。在“选择物种”中选择智 人 。在“列表类型”中勾选 基因列表 。点击 提交列表。
- 当结果可用时， 单击使用DAVID工具之一分析上面的基因列表。蜱 GOTERM_BP_DIRECT，GOTERM_CC_DIRECT，GOTERM_MF_DIRECT “基因本体”，用于GO功能富集分析。在“途径”中勾选 KEGG_Pathway ，以进行KEGG途径富集分析。
- 单击 “功能注释图 ”以显示结果。
注意：将富集分析的统计显著性阈值设置为 p < 0.05。
2. 实验设计
- FP水提取物的制备
注：FP在成都中医药大学8师林娜教授的实验室处理。- 将FP（90g）的干粉浸泡在干净的2L容量瓶中的1L纯水中。使用超声波处理（在4°C水浴中，功率：250W，频率：35kHz）帮助溶解30分钟。过滤溶液，用双层1mm x 1mm无菌医用纱布获得提取物。重复上述操作三次，以确保FP完全溶解。
- 使用旋转蒸发法进一步浓缩。将转速设置为50 rpm，温度为60°C，持续4小时。将水提取物浓缩至 100 mL。
- 将FP（0.9克/毫升）的粗提取物均匀分成两份（50毫升）。一份用作高剂量FP液体（0.9 g / mL）。将 50 mL 纯水加入另一部分，并将其视为低剂量 FP 液体 （0.45 g/mL）。使用高剂量和低剂量FP水溶液进行给药。将液体储存在-20°C直至使用。
- 动物制备
- 在室温下将50只雄性C57BL / 6小鼠（20±2g）置于通风良好的房间中，具有12小时的明暗循环，并可自由获取食物和纯净水。
- 将小鼠随机分为两组：喂养10只正常饮食的小鼠和高脂肪饮食的40只小鼠（参见 材料表）以诱导高脂血症。
注意：喂食8周后，筛选小鼠以进行进一步的药物干预。 - 在第8周，从每个小鼠眼眶中提取约200μL血液。在4°C下以5，733× g 离心血液10分钟以获得血浆样品。使用市售检测试剂盒测定TC和TG水平（参见 材料表）。
- 选择六只脂质水平最正常的小鼠作为无治疗对照（NC）组。选择24只血脂水平明显较高的小鼠作为高脂饮食组，并随机分为4组：高脂饮食（HFD）组、低剂量FP（FP_L）组、高剂量FP（FP_H）组和阳性对照（PC）组。
- 分别用两种剂量的FP（低剂量，4.5 g / kg和高剂量，9 g / kg）对FP_L和FP_H组进行胃冲洗;用辛伐他汀片剂（5mg / kg;见 材料表）对PC组进行胃冲洗;并用相同体积的生理盐水对NC和HFD组进行胃冲洗，每天一次，持续4周。
注意：目前的研究使用FP和辛伐他汀的水溶液进行治疗。 - 在第12周，用1%戊巴比妥钠（30mg / kg）麻醉后，处死所有组的小鼠。从每只小鼠的眼眶静脉收集~400μL血液样本。
注意：用镊子刺激小鼠的脚趾和脚底。如果没有反应，则证明麻醉充分。 - 在4°C下以5，733× g 离心血液10分钟以获得血浆样品，并使用市售的测定试剂盒测定TC，TG，LDL-C和HDL-C水平（参见 材料表）。获取肝组织样本16 并对其进行组织病理学分析。使用剩余的血浆和肝脏样本进行代谢组学分析（步骤3）。
注意：所有样品均储存在-80°C直至使用。
- 肝脏组织病理学检查
- 用4%多聚甲醛溶液固定新鲜肝组织超过24小时。从固定剂中取出组织，并用手术刀平滑目标组织。将组织和相应的标签放入脱水机中。
- 在乙醇梯度中脱水：75%酒精4小时，85%酒精2小时，90%酒精2小时，95%酒精1小时，无水乙醇1小时，二甲苯30分钟。将组织盒放入石蜡中的组织模具中洗涤三次，每次30分钟16。
- 将浸蜡的组织放入组织嵌入器中（见 材料表）。在蜡凝固之前，从脱水机中取出组织，将它们放入嵌入的盒子中，并贴上相应的标签。
- 在-20°C冷冻台中冷却蜡块，将它们从嵌入框架中取出，然后修剪蜡块。
- 使用切片机将修剪好的蜡块切成3μm厚的部分（见 材料表）。将切片漂浮在40°C的水中，将它们从载玻片中取出，然后在60°C的烤箱中烘烤。用水和干蜡烘烤后，将其取出并保持在室温下。
- 依次将切片放入二甲苯I中10分钟，二甲苯II放置10分钟，二甲苯III放置10分钟，无水乙醇I放置5分钟，无水乙醇II放置5分钟，75%酒精放置5分钟，用水洗涤16。
- 用苏木精染色溶液染色切片4分钟，1%盐酸醇溶液（75%酒精）进行区分，1%氨水溶液背蓝色，并用水洗涤。
- 用伊红染色溶液染色切片2分钟，然后用水洗涤。
- 使用放大倍率为200x和400x的光学显微镜观察切片。
- 液相色谱-质谱）LC-MS）分析
- FP的成分鉴定
注：分析使用超高效液相色谱法结合混合四极杆-轨道高分辨率质谱法（UPLC-Q-Orbirap HRMS，LC-MS;见 材料表）进行。- 精确测量1g干燥的FP粉末，并将其放入干净的50mL容量瓶中。
- 向容量瓶中加入25 mL 70%甲醇并准确称定。使用超声波处理（在4°C水浴中，功率：250W，频率：35kHz）30分钟以帮助溶解。再次准确称定，精确测定溶解后的损失，并用70%甲醇弥补损失。
注意：不要测量体积，因为容量瓶的刻度不准确，尤其是在4°C水浴后。 - 摇晃以充分混合。使用0.22μm微孔膜进行过滤。
- 血浆样品制备
- 将 100 μL 血浆（步骤 2.2.7）精确加入 1.5 mL 离心管中的双倍体积 （200 μL） 乙腈中，并用涡旋振动器涡旋至少 30 秒。对所有示例执行此过程。
- 在4°C下以17，200× g 离心所有样品10分钟。 离心后将上清液转移到新的 1.5 mL 离心管中。在氮气下干燥上清液。用 200 μL 提取溶剂（乙腈：水 = 4：1 [v/v]）复溶。
- 涡旋重构溶液至少30秒，并使用超声波处理10分钟（在4°C水浴中，功率：250W，频率：35kHz）。在4°C下以17，200× g 离心10分钟。
- 用0.22μm滤膜过滤上清液，并将其保持在4°C进行分析。
- 肝脏样本制备
- 将90mg肝组织（步骤2.2.7）在冰冷的甲醇 - 水（1：1，v / v，1mL）中匀浆1分钟，并在4°C下以21，500× g 离心10分钟。 将上清液转移到 1.5 mL 离心管中。对所有示例执行此过程。
- 按照相同的步骤再次提取沉淀物，并将上清液汇集到新的 1.5 mL 离心管中。在氮气下干燥上清液。用 300 μL 提取溶剂（甲醇：水 = 4：1 [v/v]）复溶。
- 涡旋重构溶液至少30秒，并使用超声波处理10分钟（在4°C水浴中，功率：250W，频率：35kHz）。在4°C下以17，200× g 离心15分钟。
- 用0.22μm滤膜过滤上清液，并将其保持在4°C进行分析。
注意：混合质控（QC）样品是通过混合来自每个血浆和肝脏样品的10μL等分试样（每六个样品一个）来制备的。
- LC-MS分析参数
注意：流动相由0.1%甲酸（溶剂A）和乙腈（溶剂B）组成。将这些溶剂转移到干净的玻璃瓶中，并将它们与LC-MS系统连接。- 在LC-MS系统的“入口文件”中设置血浆样品的梯度程序如下：1%B（0-1.5分钟），1%-60%B（1.5-13.0分钟），60%-99%B（13.0-20.0分钟），保持在99%B（20.0-25.0分钟），99%-1%B（25.0-25.1分钟），并保持在1%B直到27分钟。
- 在LC-MS系统的“入口文件”中设置血浆样品的自动进样器条件如下：进样体积，2 μL;以及每次分析的流速 0.3 mL/min。
- 在LC-MS系统的“入口文件”中设置肝脏样品的梯度程序如下：1%B（0-1分钟），1%-53%B（1-15分钟），53%-70%B（15-30分钟），70%-90%B（30-32分钟），90%-95%B（32-40分钟），95%-1%B（40-42分钟），并保持在1%B直到45分钟。
- 在LC-MS系统的“入口文件”中设置肝脏样品的自动进样器条件如下：进样体积，5 μL;以及每次分析的流速 0.3 mL/min。
- 在LC-MS系统的“MS调谐文件”中设置血浆和肝脏样品的MS检测条件。使用正电离和负电离模式进行MS采集。
注：加热电喷雾电离参数如下：喷雾电压：正电离3.5kV，负电离3.8kV;护套气体流量：55 ARB;辅助气体流量：15 ARB;探头加热器温度：300°C;毛细管温度：350°C。 - 将收集的原始数据导入化合物发现器软件，并按照制造商的说明设置方法模板（参见 材料表）。
- FP的成分鉴定
3. 代谢组学验证
注意：血浆和肝脏代谢物的代谢组学分析数据导入化合物发现器软件，通过采用分子特征提取算法进行代谢特征提取。参数设置如下：质量偏差，5 x 10-6;质量范围，100-1，500;信噪比 （SNR） 阈值，3;和保留时间偏差，0.05。通过QC峰面积的相对标准偏差（RSD）评估代谢组学的稳定性和可重复性。
- 使用SIMCA-P软件（参见 材料表）对LC-MS结果获得的积分值进行多变量统计分析。对均值中心数据和样本类建模使用正交偏最小二乘判别分析 （OPLS-DA）。
- 在OPLS-DA检验之后，考虑代谢物，在学生t检验的投影（VIP）值中具有可变重要性的积分>1和p值<0.05作为潜在的差异代谢物。
- 通过开放数据库来源识别干扰的代谢物和代谢途径，包括人类代谢组（HMDB; http://www.hmdb.ca/），京都基因和基因组百科全书（KEGG; https://www.kegg.jp/）和MetaboAnalyst5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）。
- 通过MetaboAnalyst5.0和“Wu Kong”平台（https://www.omicsolution.com/wkomics/main/）可视化结果视图。
4. 分子对接
- 分别从TCMSP数据库中下载所选FP成分的3D结构。在“化学名称”搜索框中搜索成分名称，并以mol2格式下载相应的3D结构文件。
- 从AlphaFold蛋白结构数据库（AlphaFold DB;，https://alphafold.ebi.ac.uk/）下载关键靶标的晶体结构。在搜索框中搜索目标名称，下载pdb格式的相应晶体结构文件。
- 将成分和目标结构文件导入AutoDockTools软件。单击 编辑>删除水 以删除水分子。单击“ 编辑>氢”>“添加 ”以添加氢。将成分设置为“配体”，并通过选择整个靶标作为“受体”来执行盲对接17。
- 在“中心”和“大小”后面的框中输入一个值以调整新开发的空间，从而可以完全包含配体和受体。以 pdbqt 格式保存配体和受体文件。
- 使用 AutoDock Vina 执行分子对接。将“受体”栏设置为“receptor.pdbqt”的名称，将“配体”栏设置为“ligand.pdbqt”的名称。获得配体与受体结合的最佳位置。记录最佳位置的结合能值。
注意：对接过程由遗传算法14 计算。所有停靠运行选项均为默认值。对接框架将自动从最高到最低的绑定能量排名。 - 将对接文件导入PILP（蛋白质-配体相互作用分析器 https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index）以获取视觉系统模型。下载 pse 格式的模型文件，并将其导入 PyMOL 软件（参见材料表）以构建进一步的可视化。
5. 统计分析
注意：使用SPSS统计软件（见 材料表）进行数据分析。将 p < 0.05 的值视为具有统计显著性。
- 将值表示为标准差 （SD） ±均值。
- 执行单因素方差分析，然后是事后最小显著差异 （LSD）、Dunnett（方差相等）或邓内特 T3（方差不相等的情况下），以检验组间的统计显著性。
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Representative Results
网络药理学
根据数据库和LC-MS分析的药代动力学和药效学特性，共筛选了FP中的18种潜在成分（总离子色谱图见 补充图1）。通过相关文献，没食子酸的含量远高于其他成分，可有效降低脂质9，11。因此，这种成分也被认为是一种潜在的成分。总共确定了19个成分和134个与FP相关的成分目标。所有19种成分如 表1所示。为了选择最具代表性的成分进行进一步分析，这些成分被导入中医分子机械生物信息学分析工具数据库（BATMAN-TCM; http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）。根据成分-靶点-途径-疾病网络，一些生物活性成分，如没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇，被确定为与高胆固醇血症和冠状动脉粥样硬化相关的FP的最重要成分（补充图2）。其中，没食子酸是研究最广泛的酚酸之一;它是FP18中介绍的主要生物活性成分。同时，没食子酸也是FP中含量最高的成分;其浓度通常为1%至3%。El-Hussainy等人19 揭示了没食子酸可以限制心脏损伤，改善脂质谱，并下调心脏炎症标志物。槲皮素和β-谷甾醇的含量较低，但一些研究已经证明了它们对降低脂质的作用。槲皮素作为一种广泛存在于植物中的重要类黄酮，具有抗氧化、抗炎和心血管保护作用等多种特性20。Lu等人21 研究，富含槲皮素的果汁可以减弱轻度高胆固醇血症健康个体的TC，LDL-C和HDL-C水平。至于β-谷甾醇，临床研究表明，植物甾醇可以显著预防高胆固醇血症和心血管疾病22，23。Althwab等24证明β-谷甾醇可以改善HFD大鼠的脂质谱和致动脉粥样硬化指数。由此可见，FP的降脂作用可能与这三种成分有关。
此外，从Genecards，OMIM和TTD数据库中收集了1，552个与高脂血症相关的靶点。将134个FP相关靶点与高脂血症相关靶点匹配后，确定了62个靶点作为FP对抗高脂血症的潜在靶点（图2A）。根据UniProt数据库，所有相交的目标都被规范化为它们的官方符号。随后，通过STRING（图2B）和Cytoscape（图2C）构建PPI网络。结合计算方法的得分，排名前10位的目标是ESR1，RELA，FOS，EGFR，HIF1A，AR，CCND1，IL6，MAPK8和MYC。详细信息见 补充图3。所有这62个靶点都是进一步分析的基础，并与代谢组学的结果相结合。
GO和KEGG通路通过富集分析进行。根据靶标数量选择前 15 条通路，根据 p 值进行分析。GO富集结果表明，FP对抗高脂血症的生物学过程和分子功能主要与基因表达和蛋白结合有关（图2D）。KEGG富集证明FP可以干预脂质代谢和动脉粥样硬化的过程（图2E），这意味着FP通过影响脂质代谢来缓解高脂血症。
FP对血脂水平和肝脏指数的影响
为了测试FP对高脂血症的改善效果，首先测量了TC，TG，LDL-C，HDL-C和肝脏指数（肝脏重量与体重之比）的变化。与NC组相比，HFD组小鼠血浆TC（p < 0.001）、LDL-C（p < 0.001）和TG（p < 0.05）水平显著升高，表明长期HFD干预可升高血脂水平并诱发高脂血症（图3）。
给予FP水提取物后，FP_L组和FP_H组的TC水平分别显着降低 18.8%和12.4%（p<0.05）（图3A）。FP_L组和FP_H组LDL-C水平分别显著降低 13.7%和21.8%（p<0.05）（图3B）。关于HDL-C水平，与HFD组相比，FP_H组从1.81±0.08 mmol/L显着增加（p < 0.01）增加到2.65 ±0.16 mmol/L（图3C）。尽管FP干预后TG水平仍然不显着，但与HFD组相比，TG水平有所降低（图3D）。最近的研究表明，在预测心血管疾病方面，LDL-C/HDL-C比率的指数比单独的LDL-C或HDL-C更好25，26。与HFD组相比，FP_H组LDL-C/HDL-C比值显著降低46.3%（p <0.01）（图3E），这意味着FP干预降低了坏胆固醇，增加了好胆固醇水平。作为主要的脂肪代谢器官，肝脏重量在一定程度上反映了小鼠的脂肪储存27。12周后，与HFD组相比，FP_L组和FP_H组的肝脏指数显着降低（p < 0.01）（图3F）。PC组在上述这些指标上也表现出不同程度的降低，表明FP与他汀类药物具有相似的效果，并且保护作用表现出剂量-反应关系。
各种临床研究表明，服用提取物或整个FP一段时间后，TC和LDL-C水平显着降低。同时，HDL-C水平在长期服用FP28，29后显着提高。Nambiar和Shetty30 发现FP汁可以减少氧化的低密度脂蛋白，从而大大降低动脉粥样硬化的风险。Gopa等人31 评估了FP对高脂血症患者的降血脂作用，并将其与辛伐他汀进行了比较。FP治疗导致TC，LDL-C和TG显着降低，HDL-C水平显着增加，类似于辛伐他汀。本研究与辛伐他汀的治疗效果相似，FP的LDL-C降沉作用和补肝作用优于辛伐他汀。
肝脏组织病理学观察
FP对HFD小鼠肝脂肪变性的影响如图4所示。NC组的肝脏病理切片表现出规则的肝细胞形态，明确定义的细胞边界，并且没有明显的脂肪液泡（图4A，B）。相比之下，HFD组血管周围有不同大小的脂肪液泡，并表现出明显的肝损伤，表现为细胞肿胀，脂肪变性，细胞边界丧失，细胞收缩和肝细胞坏死（图4C，D）。如图4E，F所示，FP干预可以改善肝脏脂肪变性，特别是在FP_L组中。与HFD组相比，FP_H组（图4G，H）和PC组（图4I，J）肝细胞结构有一定程度的恢复，脂肪变性，脂肪液泡减少。这意味着FP干预可以保护肝组织免受HFD诱导的肝损伤。
代谢组学分析
根据血脂水平和肝脏组织病理学观察，高剂量FP对高脂血症的影响优于低剂量FP。因此，选择NC、HFD和FP_H组分析其代谢水平的变化。QC样品的总离子色谱图如 补充图4所示。为了确保数据的准确性，从所有QC样品中去除了RSD值为>30%的特征。PCA和离子色谱图显示QC样品在此过程中是稳定的（补充图5）。经过数据预处理后，血浆和肝脏中分别测定了626个和562个特征。其中，根据KEGG数据库分别鉴定血浆和肝脏中的120和124种代谢物。采用OPLS-DA分析探讨NC、HFD和FP_H组之间的分离。OPLS-DA显示，同一组样本聚集在一起，不同组样本区分良好（图5A，B）。这些结果表明，HFD和FP干预引起明显的代谢变异。
为了确定有助于代谢区分的潜在差异代谢物，分别对NC与HFD和HFD与FP_H进行了进一步的OPLS-DA和t检验分析。OPLS-DA结果区分良好，并显示不同模型组之间的显着差异14 （补充图6）。基于VIP（投影中重要的变量）>1和 p <0.05，血浆中32种代谢物在NC组和HFD组之间表现出分化，72种代谢物在HFD和FP_H组之间表现出分化。在肝脏中，38种代谢物在NC组和HFD组之间表现出分化，17种代谢物在HFD组和FP_H组之间表现出差异化。最后，分别在血浆和肝脏中鉴定出16和6种代谢物作为影响FP的HFD小鼠的差异代谢物（补充图7）。这些代谢物的信息如 表2所示。
为了可视化三组之间代谢物的变化，通过MetaboAnalyst 5.0绘制了热图。血浆和肝脏中所有差异代谢物在HFD组中均发生改变，其中大多数在FP组中逆转，表明FP干预可以改善代谢紊乱（图5C，D）。此外，将差异代谢物导入MetaboAnalyst 5.0以探索HFD小鼠中FP的代谢途径。基于 p < 0.05和途径影响>0.10，血浆中的色氨酸代谢受到显着影响，与该途径相关的代谢产物为D-色氨酸和L-犬尿氨酸（图5E）。Jung等人32 研究，长期高脂血症可能会降低犬尿氨酸的血清水平。牛磺酸和次牛磺酸代谢在肝脏中受到显着影响，相关的代谢物相关是牛磺酸（图5F）。牛磺酸是动物体内重要且必需的氨基酸;Dong等33 研究牛磺酸可轻度降低血脂损伤，降低HFD引起的动脉粥样硬化风险。在这项研究中，FP干预增加了L-犬尿氨酸和牛磺酸的含量，这与血脂水平的降低呈正相关，支持FP对抗高脂血症的有效性。
网络药理学和代谢组学的综合分析
网络药理学结合代谢组学的综合策略在研究疾病机制和干预策略中越来越不可或缺。在证据有限的情况下建立了网络药理学与代谢组学之间的相关性。为了全面了解FP对抗高脂血症的机制，构建了基于网络药理学和代谢组学的相互作用网络。将差异代谢物导入Cytoscape中的MetScape插件中，并与网络药理学中鉴定的枢纽基因匹配，以收集化合物-反应-酶-基因网络（图6）。如 表3所示，在血浆代谢物中，L-犬尿氨酸和皮质酮与CYP1A1有关，可催化脂质过氧化，诱发非酒精性脂肪肝34，35;受影响的途径分别为色氨酸代谢和类固醇激素生物合成。乙酰胆碱与AChE有关，影响甘油磷脂代谢。在肝脏代谢物中，MGAM和棉子糖与半乳糖代谢有关。一些研究表明，摄入棉子糖家族低聚糖可以改善HFD小鼠的代谢紊乱36。
此外，已经构建了成分-靶点-代谢物-途径网络（图7）。在成分中，槲皮素连接边缘最多，说明FP的槲皮素在降低脂质方面起着最重要的作用。上述综合分析揭示了FP抗高脂血症的关键靶点、代谢产物和通路，可为进一步研究该药的治疗机制和临床应用奠定基础。
分子对接
为了进一步研究所选成分与关键靶标之间相互作用的可能性，使用分子对接来分析其配体-活性位点相互作用。使用AutoDock Vina软件（见 材料表）进行分子对接，并根据评分函数的等级输出第一个对接姿势。对接结果如图 8 所示。
在综合分析中，CYP1A1、AChE和MGAM与差异代谢物有关;他们在靶标和代谢物之间架起了桥梁。进行进一步的分子对接以验证靶标与成分之间的关系。与CYP1A1对接的结果如下：没食子酸通过氨基酸残基Asn-185、Tyr-187、Asn-219和His-500形成4个氢键，通过氨基酸残基Tyr-187形成π-π堆积相互作用（图8A）;槲皮素通过 Asn-185、Asn-219 和 His-500 形成三个氢键、疏水相互作用和通过 Tyr-187 形成π-π堆积相互作用（图 8B）;β-谷甾醇通过Arg-362、Ser-363、Leu-365和Arg-464形成四个氢键，并通过Glu-369和Ile-439形成疏水相互作用（图8C）。结合能分别为5.3、7.0和7.3 kcal/-mol。在与AChE的相互作用中，没食子酸通过与Arg-237，Arg-238和Arg-480的氢键稳定（图8D）;槲皮素通过与Arg-237和Phe-474的氢键，与Phe-157的疏水相互作用以及与Tyr-478的π-π堆积相互作用来稳定（图8E）;β-谷甾醇通过与Phe-157、Val-244、Ile-248、Phe-474、Ala477和TYR478的疏水相互作用而稳定（图8F）。结合能分别为5.0、6.5和8.0 kcal/-mol。在与MGAM的相互作用中，没食子酸通过与Ile-1716，Gly-1747和Trp-1749的氢键以及与Tyr-1715和Trp-1749的疏水相互作用来稳定（图8G）;槲皮素通过与Arg-1311，Thr-1726，Gln-1731和Trp-1752的氢键，通过与Arg-1730的氢键以及与His-1727的π-π堆叠来稳定（图8H）;β-谷甾醇通过疏水作用稳定与Pro-1159、Trp-1355、Phe-1427和Phe-1560，结合能分别为5.9、8.1和6.9 kcal/mol。关于相互作用和结合亲和力的详细信息如表4所示。多个结合位点和高结合能解释了成分与蛋白质靶标之间的高亲和力，验证了这些成分通过作用于高脂血症相关靶标而发挥降低脂质的作用。
图1：综合战略的示意图。 通过网络药理学提取枢纽成分和基因（第1部分）。通过血浆和肝脏代谢组学分析FP对高脂血症的差异代谢物（第2部分）。基于对第1部分和第2部分（第3部分）的综合分析，确定并连接了关键靶点、代谢物和途径。 请点击此处查看此图的大图。
图2：FP对高脂血症影响的靶点筛选、网络构建和富集分析 。 （A）FP高脂血症靶点的维恩图。（B）潜在的活性药物-成分-靶点-疾病网络：此处提到的不同颜色符号：疾病（红色）、药物（蓝色）、成分（绿色）和靶点（黄色）。（C） 按字符串划分的 PPI 网络。（D）GO途径富集分析。（E）KEGG途径富集分析。 请点击此处查看此图的大图。
图3：FP对HFD诱导的高脂血症小鼠血浆脂质水平和肝指数的影响（n = 6）。 （a） TC水平。（b） 低密度脂蛋白-丙的水平。（C） 高密度脂蛋白-C 水平。（四）TG水平。（E） 低密度脂蛋白-丙/高密度脂蛋白-碳比率。（F）肝脏指数*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。使用单因素方差分析评估统计学上的显着差异，然后使用邓内特多重比较检验或事后分析进行评估。请点击此处查看此图的大图。
图4：FP对HFD诱导的高脂血症（H&E染色）小鼠肝组织的影响。 （A，B）NC组，（C，D）HFD组，（E，F）FP_L组，（G，H）FP_H组，（I，J）PC组（n = 6）。比例尺：（A，C，E = 200 μm; B，D，F = 50 μm）。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：差异代谢物的 OPLS-DA 评分图、热图和代谢途径。血浆（A）和肝脏（B）中HFD小鼠的FP的OPLS-DA评分图。血浆（C）和肝脏（D）中差异代谢物的热图。血浆（E）和肝脏（F）中差异代谢物的代谢途径。请点击此处查看此图的大图。
图6：关键代谢物和靶标的化合物-反应-酶-基因网络。 低度节点已被移除。红色六边形、蓝色圆圈、圆形绿色矩形和灰色菱形分别代表活性化合物、基因、蛋白质和反应。关键靶标和代谢物被放大。具有白色背景的途径在等离子体中受到显着调节。灰色背景的通路在肝脏中受到显着调节。 请点击此处查看此图的大图。
图7：成分-靶点-代谢物-途径网络。 颜色越深，连接的边缘越多，表示节点在此网络中更为重要。 请点击此处查看此图的大图。
图8：FP成分和关键靶点的相互作用图。 （A）作用于CYP1A1的没食子酸。（B）作用于CYP1A1的槲皮素。（C） 作用于CYP1A1的β-谷甾醇。（D）作用于AChE的没食子酸。（E） 作用于AChE的槲皮素。（F） β-谷甾醇作用于AChE。（G）作用于MGAM的没食子酸。（H） 作用于MGAM的槲皮素。（I）作用于MGAM的β-谷甾醇。请点击此处查看此图的大图。
图 9：FP 对抗高脂血症结果的概述。 请点击此处查看此图的大图。
表1：FP水提取物的选定成分。请按此下载此表格。
表2：三组之间的差异代谢物。请按此下载此表格。
表3：关于关键靶点、代谢物和途径的信息。请按此下载此表格。
表4：FP成分和靶蛋白之间的结合位点和作用力。请按此下载此表格。
附图1：FP水浸出物的正负离子色谱图。请点击此处下载此文件。
补充图2：蝙蝠侠中医的FP成分-靶点-通路-疾病网络。请点击此处下载此文件。
补充图3：网络药理学中枢纽基因的频率分析。请点击此处下载此文件。
补充图4：血浆和肝脏QC样品的离子色谱图。 血浆QC样品的代表性正（A）和负（B）离子色谱图。肝脏QC样品的代表性正（C）和负（D）离子色谱图。 请点击此处下载此文件。
补充图5：血浆（A）和肝脏（B）QC样品的PCA评分图。请点击此处下载此文件。
补充图6：血浆（A和B）和肝脏（C和D）样品的OPLS-DA评分图。请点击此处下载此文件。
补充图7：血浆（A）和肝脏（B）样品中差异代谢物的维恩图。请点击此处下载此文件。
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Discussion
近年来，高脂血症的发病率一直在上升，主要是由于长期不健康的饮食习惯。中药及其化学成分具有多种药理活性，近年来已被广泛研究37，38。FP是一种水果资源，既可用作药物，又可用作食品，具有治疗高脂血症的重要潜力。然而，FP对抗高脂血症的潜在治疗机制有待进一步研究。
网络药理学在分子水平上评估药物多药理作用，并预测天然产物和蛋白质的相互作用以确定主要机制39。第一步是选择药物的有效成分和关键靶点。在这项研究中，发现了9种活性成分和62个枢纽基因。为进一步了解FP对高脂血症的分子机制，基于网络药理分析建立了PPI和成分-靶点网络。为了缩小关键成分和靶点的范围，蝙蝠侠中医创立了与高胆固醇血症和冠状动脉粥样硬化相关的三种关键成分（没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇）。所有这些成分都可以降低LDL-C水平或增加HDL-C水平，验证FP对高脂血症的具体作用。此外，根据KEGG富集分析，FP对高脂血症的作用与脂质和动脉粥样硬化途径的活性有关。该方法虽然过于依赖数据库，缺乏实验验证，但具有理论价值，为后续的实验验证研究提供了思路。
为了进一步的实验验证，给小鼠喂食补充脂肪的饮食8周以诱导高脂血症。结果显示，血浆TC、LDL-C和TG水平显著升高。虽然HDL-C水平显著下降，但LDL-C与HDL-C的比例显著增加。组织病理学观察显示，HFD小鼠肝组织受损严重，但肝指数无明显升高;可能是体重和内脏重量的变化需要更长的时间。血脂和肝脏变化充分表明FP对高脂血症的干预作用。然而，干预效果的内在机制仍需进一步探索。
代谢组学提供了潜在代谢物和相关途径的列表，旨在探索代谢疾病的机制和治疗药物的作用40。代谢组学的结果可能受到样品类型的影响。考虑高脂血症的致病特征，选取血浆和肝脏样本进行代谢组学分析。根据OPLS-DA结果，NC、HFD和FP_H组的代谢产物区分良好。血浆中共发现16种差异代谢物，肝脏中发现6种差异代谢物。血浆中受影响的代谢物多于肝脏，证明血液是高脂血症诱导代谢紊乱的主要场所。FP干预可以在HFD的影响下逆转这些代谢物的变化。此外，这些差异代谢物被导入KEGG数据库。血浆中差异代谢物的显著代谢途径是色氨酸代谢，肝脏中是牛磺酸和次牛磺酸代谢。在这项研究中，FP干预增加了色氨酸代谢的L-犬尿氨酸含量和牛磺酸和次牛磺酸代谢的牛磺酸含量，这意味着FP可以有效调节代谢紊乱和高脂血症。代谢组学分析揭示了哪些代谢产物与高脂血症或FP干预有关，并确定了FP效应的下游机制。
通过将网络药理学结果与代谢组学相结合，在化合物-反应-酶-基因网络中鉴定了3个关键靶点（CYP1A1、AChE和MGAM）。根据分子对接分析，这些靶标与FP成分（没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇）表现出高亲和力。4种代谢产物（L-犬尿氨酸、皮质酮、乙酰胆碱和棉子糖）和4种相关途径（色氨酸代谢、类固醇激素生物合成、甘油磷脂代谢和半乳糖代谢）被确定为关键代谢产物和代谢途径。其中，槲皮素与靶标相关最多，色氨酸代谢同时出现在代谢组学和综合结果中。它们在FP对高脂血症的治疗效果中起着最重要的作用。分子对接结果表明，CYP1A1、AChE和MGAM与成分具有较高的亲和力。以上结果证明，这些筛选的靶点与FP的治疗效果密切相关。
本研究将没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇确定为抗高脂血症的FP活性成分，色氨酸代谢是HFD小鼠FP治疗的主要代谢途径。结果概述如图 9 所示。本研究为进一步研究机理提供了数据和理论支持，为FP医学的临床应用提供了基础。这也证明天然食品可能是一种有前途的选择，在临床实践中具有广阔的前景。但是，这项研究仍然存在一些不足。单独使用活性成分对高脂血症的治疗效果尚未得到证实。此外，尚未研究关键目标的路径;还需要进一步系统的分子生物学实验来验证其准确的机制。
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Disclosures
所有作者都声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了中医养生康复产品开发创新团队（2022C005）和“养生康复+”新业务跨界融合研究的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | \ | |
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | \ | |
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | \ | |
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | \ | |
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | \ | |
| DM500 Optical Microscope | Leica | \ | |
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | \ | |
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | \ | |
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | \ | |
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | \ | |
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | \ | |
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | \ | Version 2.3.2 |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | \ | Version 14.1 |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | \ | |
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | \ | Version 26.0 |
| SIMCA-P | Umetrics AB | \ | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | \ | |
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | \ | |
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
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