Summary

Élucider le métabolisme du 2,4-dibromophénol chez les plantes

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

Le présent protocole décrit une méthode simple et efficace pour l’identification des métabolites du 2,4-dibromophénol chez les plantes.

Abstract

Les cultures peuvent être largement exposées aux polluants organiques, car le sol est un puits important pour les polluants rejetés dans l’environnement. Cela crée une exposition humaine potentielle par la consommation d’aliments polluants accumulés. L’élucidation de l’absorption et du métabolisme des xénobiotiques dans les cultures est essentielle pour l’évaluation du risque d’exposition alimentaire chez l’homme. Cependant, pour de telles expériences, l’utilisation de plantes intactes nécessite des expériences à long terme et des protocoles complexes de préparation d’échantillons qui peuvent être affectés par divers facteurs. Les cultures de callosités végétales combinées à la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) peuvent fournir une solution pour l’identification précise et rapide des métabolites des xénobiotiques dans les plantes, car elles peuvent éviter les interférences du microenvironnement microbien ou fongique, raccourcir la durée du traitement et simplifier l’effet de matrice des plantes intactes. Le 2,4-dibromophénol, un retardateur de flamme et un perturbateur endocrinien typique, a été choisi comme substance modèle en raison de sa présence répandue dans le sol et de son potentiel d’absorption par les plantes. Ici, des callosités végétales ont été générées à partir de graines d’asepsie et exposées à un milieu de culture stérile contenant du 2,4-dibromophénol. Les résultats ont montré que huit métabolites du 2,4-dibromophénol ont été identifiés dans les tissus calleux des plantes après 120 h d’incubation. Cela indique que le 2,4-dibromophénol a été rapidement métabolisé dans les tissus calleux des plantes. Ainsi, la plateforme de culture de callosités végétales est une méthode efficace pour évaluer l’absorption et le métabolisme des xénobiotiques chez les plantes.

Introduction

Un nombre croissant de polluants organiques ont été rejetés dans l’environnement en raison des activités anthropiques 1,2, et le sol est considéré comme un puits important pour ces contaminants 3,4. Les contaminants présents dans le sol peuvent être absorbés par les plantes et potentiellement transférés à des organismes de niveau trophique supérieur le long des chaînes alimentaires, en pénétrant directement dans le corps humain par la consommation des cultures, ce qui entraîne une exposition involontaire 5,6. Les plantes utilisent différentes voies pour métaboliser les xénobiotiques à des fins de détoxification7 ; Il est important d’élucider le métabolisme des xénobiotiques, car ils contrôlent le devenir réel des contaminants dans les plantes. Comme les métabolites peuvent être excrétés par les feuilles (dans l’atmosphère) ou les racines, la détermination des métabolites dans les toutes premières phases de l’exposition offre donc la possibilité de tester un nombre étendu de métabolites8. Cependant, les études utilisant des plantes intactes nécessitent des expériences à long terme et des protocoles complexes de préparation d’échantillons qui peuvent être affectés par divers facteurs.

Les cultures de callosités végétales sont donc une bonne alternative pour étudier le métabolisme des xénobiotiques in planta, car elles peuvent réduire considérablement le temps de traitement. Ces cultures excluent les interférences microbiennes et la dégradation photochimique, simplifient l’effet matriciel des plantes intactes, standardisent les conditions de culture et nécessitent moins d’efforts expérimentaux. Les cultures de callosités végétales ont été appliquées avec succès comme approche alternative dans les études métaboliques du triclosan9, du nonylphénol10 et du tébuconazole8. Ces études ont montré que les schémas métaboliques dans les cultures de callosités étaient similaires à ceux des plantes intactes. Cette étude propose une méthode d’identification efficace et précise des métabolites des xénobiotiques chez les plantes sans protocoles complexes et chronophages. Ici, nous utilisons des cultures de callosités végétales en combinaison avec la spectrométrie de masse à haute résolution pour l’analyse des métabolites avec des signaux de faible intensité11,12.

À cette fin, des suspensions de callosités de carotte (Daucus carota var. sativus) ont été exposées à 100 μg/L de 2,4-dibromophénol pendant 120 h dans un agitateur à 130 tr/min et à 26 °C. Le 2,4-dibromophénol a été choisi en raison de son activité endocrinienne perturbatrice13 et de sa présence répandue dans le sol14. Les métabolites ont été extraits et analysés par spectrométrie de masse à haute résolution. Le protocole proposé ici permet d’étudier le métabolisme in planta d’autres types de composés organiques qui peuvent être ionisés.

Protocol

1. Différenciation des callosités de la carotte REMARQUE : Autoclaver tous les équipements utilisés ici et effectuer toutes les opérations dans un établi ultra-propre stérilisé aux UV. Vernaliser les graines en immergeant les graines de carotte uniformes (Daucus carota var. sativus) dans de l’eau déminéralisée à 4 °C pendant 16 h. Stérilisez les graines vernalisées en surface avec de l’éthanol à 75 % pendant 20 minutes, puis r…

Representative Results

Les étapes du protocole sont illustrées à la figure 1. En suivant le protocole, nous avons comparé le chromatogramme de l’extrait de callosité de carotte du traitement au 2,4-dibromophénol aux témoins, et avons trouvé huit pics distincts qui sont présents dans le traitement au 2,4-dibromophénol mais absents chez les témoins (Figure 2). Cela indique qu’un total de huit métabolites du 2,4-dibromophénol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 et …

Discussion

Ce protocole a été développé pour identifier efficacement la biotransformation des xénobiotiques chez les plantes. L’étape critique de ce protocole est la culture du cal de la plante. La partie la plus difficile est la différenciation et le maintien du cal de la plante, car le cal de la plante est facilement infecté et développé en tissus végétaux. Par conséquent, il est important de s’assurer que tout l’équipement utilisé est autoclavé et que toutes les opérations sont effectuées dans des conditi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (21976160) et le projet de recherche sur l’application des technologies de bien-être public de la province du Zhejiang (LGF21B070006).

Materials

2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
4-n-NP, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4 Pointe-Claire
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography Waters
Amber glass vials Waters
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
C18 column ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge Thermo Fisher
DB-5MS capillary column Agilent
Dichloromethane Sigma-Aldrich 40071190-4L
Freeze dryer SCIENTZ 
High-throughput tissue grinder SCIENTZ 
Methanol Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer Bruker Daltonics
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
N-hexane Sigma-Aldrich H109658-4L
Nitrogen blowing instrument  AOSHENG MD200-2
NP isomers, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges Waters 60 mg/3 mL
Research plus Eppendorf 100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)  Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. THZ-98AB
Solid phase extractor AUTO SCIENCE
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench AIRTECH

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Cite This Article
Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou, Q., Zhang, A., Sun, J. Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants. J. Vis. Exp. (192), e65089, doi:10.3791/65089 (2023).

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