Summary

Elucidando o metabolismo do 2,4-dibromofenol em plantas

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para a identificação de metabólitos do 2,4-dibromofenol em plantas.

Abstract

As culturas podem ser extensivamente expostas a poluentes orgânicos, uma vez que o solo é um importante sumidouro de poluentes descartados no meio ambiente. Isso cria exposição humana potencial através do consumo de alimentos acumulados por poluentes. A elucidação da absorção e metabolismo de xenobióticos em culturas é essencial para a avaliação do risco de exposição dietética em humanos. No entanto, para tais experimentos, o uso de plantas intactas requer experimentos de longo prazo e protocolos complexos de preparação de amostras que podem ser afetados por vários fatores. Culturas de calos vegetais combinadas com espectrometria de massas de alta resolução (HRMS) podem fornecer uma solução para a identificação precisa e econômica de metabólitos de xenobióticos em plantas, pois pode evitar a interferência do microambiente microbiano ou fúngico, encurtar a duração do tratamento e simplificar o efeito de matriz de plantas intactas. O 2,4-dibromofenol, um retardante de chama típico e desregulador endócrino, foi escolhido como substância modelo devido à sua ampla ocorrência no solo e ao seu potencial de absorção pelas plantas. Neste trabalho, calos vegetais foram gerados a partir de sementes de assepsia e expostos a meio de cultura estéril contendo 2,4-dibromofenol. Os resultados mostraram que oito metabólitos do 2,4-dibromofenol foram identificados nos tecidos do calo vegetal após 120 h de incubação. Isso indica que o 2,4-dibromofenol foi rapidamente metabolizado nos tecidos do calo vegetal. Assim, a plataforma de cultura de calos vegetais é um método eficaz para avaliar a absorção e o metabolismo de xenobióticos em plantas.

Introduction

Um número crescente de poluentes orgânicos tem sido descartado no meio ambiente devido às atividades antrópicas 1,2, sendo o solo considerado um importante sumidouro desses contaminantes 3,4. Os contaminantes presentes no solo podem ser absorvidos pelas plantas e potencialmente transferidos para organismos de nível trófico superior ao longo das cadeias alimentares, entrando diretamente no corpo humano por meio do consumo das culturas, levando consequentemente à exposição não intencional 5,6. As plantas utilizam diferentes vias para metabolizar xenobióticos para desintoxicação7; A elucidação do metabolismo dos xenobióticos é importante, pois controla o real destino dos contaminantes nas plantas. Como os metabólitos podem ser excretados pelas folhas (para a atmosfera) ou pelas raízes, a determinação dos metabólitos nas fases iniciais de exposição oferece a possibilidade de testar um número extenso de metabólitos8. No entanto, estudos utilizando plantas intactas requerem experimentos de longa duração e protocolos complexos de preparo de amostras que podem ser afetados por vários fatores.

As culturas de calos vegetais, portanto, são uma boa alternativa para estudar o metabolismo de xenobióticos em planta, pois podem encurtar muito o tempo de tratamento. Essas culturas excluem a interferência microbiana e a degradação fotoquímica, simplificam o efeito de matriz de plantas intactas, padronizam as condições de cultivo e requerem menor esforço experimental. Culturas de calos vegetais têm sido aplicadas com sucesso como uma abordagem alternativa em estudos metabólicos de triclosan9, nonilfenol10 e tebuconazol8. Esses estudos mostraram que os padrões metabólicos nas culturas de calos foram semelhantes aos das plantas intactas. Este trabalho propõe um método para a identificação eficiente e precisa de metabólitos de xenobióticos em plantas sem protocolos complexos e demorados. Neste trabalho, utilizamos culturas de calos vegetais em combinação com espectrometria de massas de alta resolução para a análise de metabólitos com sinais de baixa intensidade11,12.

Para tanto, suspensões de calos de cenoura (Daucus carota var. sativus) foram expostas a 100 μg/L de 2,4-dibromofenol por 120 h em agitador a 130 rpm e 26 °C. O 2,4-dibromofenol foi escolhido devido à sua atividade endócrina disruptiva13 e ampla ocorrência no solo14. Os metabólitos foram extraídos e analisados por espectrometria de massas de alta resolução. O protocolo aqui proposto pode investigar o metabolismo in planta de outros tipos de compostos orgânicos que podem ser ionizados.

Protocol

1. Diferenciação do calo de cenoura NOTA: Autoclave todos os equipamentos utilizados aqui e realize todas as operações em uma bancada ultralimpa esterilizada por UV. Vernalizar as sementes imergindo as sementes uniformes de cenoura (Daucus carota var. sativus) em água deionizada a 4 °C por 16 h. Esterilizar superficialmente as sementes vernalizadas com etanol 75% por 20 min e, em seguida, enxaguar três vezes com água deionizada estéril em …

Representative Results

As etapas do protocolo estão representadas na Figura 1. Seguindo o protocolo, comparamos o cromatograma do extrato de calo de cenoura do tratamento com 2,4-dibromofenol com os controles, e encontramos oito picos distintos que estão presentes no tratamento com 2,4-dibromofenol, mas ausentes nos controles (Figura 2). Isso indica que um total de oito metabólitos de 2,4-dibromofenol (M562, M545, M661, M413, M339, M380, M424 e M187) foram detectados com sucesso no…

Discussion

Este protocolo foi desenvolvido para identificar eficientemente a biotransformação de xenobióticos em plantas. A etapa crítica deste protocolo é o cultivo do calo vegetal. A parte mais difícil é a diferenciação e manutenção do calo vegetal, pois o calo vegetal é facilmente infectado e desenvolvido para os tecidos vegetais. Portanto, é importante certificar-se de que todos os equipamentos utilizados sejam autoclavados e que todas as operações sejam realizadas em condições assépticas. A diferenciação e …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21976160) e pelo Projeto de Pesquisa de Aplicação de Tecnologia de Bem-Estar Público da Província de Zhejiang (LGF21B070006).

Materials

2,4-dichlorophenoxyacetic acid WAKO 1 mg/L
20% H2O2 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10011218-500ML
4-n-NP, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
4-n-NP-d4 Pointe-Claire
6-benzylaminopurine WAKO 0.5 mg/L
75% ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 1269101-500ML
7890A-5975 gas chromatography Agilent
ACQULTY ultra-performance liquid chromatography Waters
Amber glass vials Waters
Artificial climate incubator Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD RDN-1000A-4
Autoclaves STIK MJ-Series
C18 column ACQUITY UPLC BEH
Centrifuge Thermo Fisher
DB-5MS capillary column Agilent
Dichloromethane Sigma-Aldrich 40071190-4L
Freeze dryer SCIENTZ 
High-throughput tissue grinder SCIENTZ 
Methanol Sigma-Aldrich
MicrOTOF-QII mass spectrometer Bruker Daltonics
Milli-Q system Millipore MS1922801-4L
Murashige & Skoog medium HOPEBIO HB8469-7
N-hexane Sigma-Aldrich H109658-4L
Nitrogen blowing instrument  AOSHENG MD200-2
NP isomers, >99% Dr. Ehrenstorfer GmbH
Oasis HLB cartridges Waters 60 mg/3 mL
Research plus Eppendorf 100-1000 µL
Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus)  Shouguang Seed Industry Co., Ltd
Shaking Incubators Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. THZ-98AB
Solid phase extractor AUTO SCIENCE
Ultrasound machine ZKI UC-6
UV-sterilized ultra-clean workbench AIRTECH

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Cite This Article
Wu, J., Yang, X., Wang, Q., Zhou, Q., Zhang, A., Sun, J. Elucidating the Metabolism of 2,4-Dibromophenol in Plants. J. Vis. Exp. (192), e65089, doi:10.3791/65089 (2023).

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