בידוד ותרבית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי בשיטה חדשנית נטולת קסנוגניות לטיפול בבני אדם
Summary
מוצרים קסנוגניים (כימיים או מן החי) שהוכנסו בשלבי ההכנה/מניפולציה של הטיפול התא קשורים לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית ולהעברה פתוגנית בחולים מארחים. כאן מתוארת שיטה שלמה נטולת קסנוגנים לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע שמקורם בשומן אנושי.
Abstract
בהתחשב בהשפעה הגוברת של טיפול בתאי גזע, הועלו חששות בטיחות ביולוגית לגבי זיהום פוטנציאלי או העברת זיהום עקב הכנסת מוצרים שמקורם מן החי במהלך מניפולציה חוץ גופית . המרכיבים הקסנוגניים, כגון collagenase או סרום בקר עוברי, המשמשים בדרך כלל במהלך שלבי בידוד והרחבת התאים עשויים להיות קשורים לסיכונים פוטנציאליים של תגובתיות חיסונית או זיהום נגיפי, חיידקי ופריון בחולים המקבלים. בהתאם להנחיות נוהלי ייצור נאותים, יש להימנע מדיסוציאציה של רקמות כימיות, בעוד שניתן להחליף את סרום הבקר העוברי (FBS) בתוספים נטולי קסנוגניות. יתר על כן, כדי להבטיח את הבטיחות של מוצרי התא, ההגדרה של שיטות אמינות יותר לשחזור חשוב. פיתחנו שיטה חדשנית, נטולת קסנוגניות לחלוטין לבידוד והרחבה חוץ גופית של תאי גזע אנושיים שמקורם בשומן מבלי לשנות את תכונותיהם בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים של קולגנאז בתרבית FBS. כאן, תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs) בודדו מרקמת השומן הבטנית. הדגימה נטחנה באופן מכני עם מספריים/אזמל, נותחה במיקרו ופוזרה מכנית בצלחת פטרי בקוטר 10 ס”מ, והוכנה עם חתכי אזמל כדי להקל על חיבור שברי הרקמה ונדידת hASCs. לאחר שלבי השטיפה, נבחרו hASCs בשל היצמדות הפלסטיק שלהם ללא עיכול אנזימטי. ה-hASCs המבודדים גודלו בתרבית עם תוספת בינונית עם 5% ליזט טסיות אדם ללא הפרין ומנותקים עם תחליף טריפסין ללא בעלי חיים. בעקבות הנחיות GMP (תנאי ייצור נאותים) על ייצור מוצרי תאים המיועדים לטיפול בבני אדם, לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה בשום אמצעי תרבית.
Introduction
בעשורים האחרונים, הביקוש הגובר לטיפולים טיפוליים חדשניים הוליד מאמצים משמעותיים והשקעת משאבים בתחום הרפואה התרגומית1. מוצרים מבוססי תאים קשורים לסיכונים הנקבעים על ידי מקור התא, תהליך הייצור (בידוד, הרחבה או שינוי גנטי), והתוספים הלא-תאיים (אנזימים, גורמי גדילה, תוספי תרבית ואנטיביוטיקה), וגורמי סיכון אלה תלויים בהתוויה הטיפולית הספציפית. האיכות, הבטיחות והיעילות של המוצר הסופי עשויים להיות מושפעים עמוקות מהאלמנטים שצוינו לעיל2. טיפול בתאי גזע דורש דבקות בעקרונות הבטיחות הביולוגית; הסיכונים הפוטנציאליים של העברה פתוגנית עם מוצרים שמקורם מן החי בתרבית תאים עלולים להיות בעייתיים, ובדיקה יסודית של כל מוצר שהוכנס לייצור היא חיונית3.
השיטה המסורתית לבידוד תאי גזע שמקורם בשומן אנושי (hASCs) כוללת עיכול אנזימטי המבוצע עם collagenase ואחריו שטיפת שלבים באמצעות צנטריפוגה4. בעוד בידוד אנזימטי נחשב בדרך כלל יעיל יותר מאשר טכניקות מכניות אחרות במונחים של תפוקת תאים וכדאיות, רכיבים שמקורם מן החי בשימוש, כגון collagenase, נחשבים יותר מניפולציה מינימלית על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי. משמעות הדבר היא שיש סיכון מוגבר באופן משמעותי לתגובות חיסוניות או העברת מחלות, ובכך להגביל את התרגום של טיפול hASC להגדרות קליניות 5,6.
עיכול מבוסס טריפסין הוא פרוטוקול אנזימטי נוסף לבידוד ASC. טכניקות שונות תוארו עם שינויים קלים במונחים של ריכוז טריפסין, מהירות צנטריפוגה, וזמן הדגירה. למרבה הצער, שיטה זו אינה מתוארת היטב, וחוסר השוואה קיים בספרות, במיוחד עם פרוטוקולי בידוד מכני7. עם זאת, במונחים של תרגום של הגישה, טריפסין יש את אותם חסרונות של collagenase.
שיטות בידוד חלופיות להשגת ASCs, המבוססות על כוחות מכניים וללא תוספת אנזימים, כוללות צנטריפוגה במהירות גבוהה (800 x גרם או 1,280 x גרם, 15 דקות) של שברי רקמת השומן. לאחר מכן, הגלולה מודגרת עם חיץ ליזה של תאי דם אדומים (5 דקות), ואחריו צעד צנטריפוגה נוסף ב 600 x גרם לפני השעיה בתווך תרבית. למרות מספר גדול יותר של תאים שבודדו בימים הראשונים בהשוואה לשיטות explant, מחקר קודם הראה התפשטות נמוכה או נעדרת מעבר לשבוע השני של תרבית8.
מלבד זאת, מניפולציה נוספת עם תוספת קסנוגנית, כגון סרום בקר עוברי (FBS), המשמש כתוסף גורם גדילה לתרבית תאים, קשורה לסיכון מוגבר לתגובתיות חיסונית וחשיפה לזיהומים ויראליים, חיידקיים או פריונים של החולה המארח 9,10. תגובות חיסוניות והתפתחות פריחה באורטיקריפורמים כבר תוארו אצל אנשים שקיבלו מספר מנות של תאי גזע מזנכימליים המיוצרים עם FBS11. יתר על כן, FBS נתון לשונות אצווה לאצווה, אשר יכולה להשפיע על איכות המוצר הסופי12.
בהתאם להנחיות תנאי ייצור נאותים (GMP), יש להימנע מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות, ויש להחליף את FBS בתוספים נטולי קסנוגניות. צעדים אלה, יחד עם פרוטוקולים אמינים יותר הניתנים לשחזור, חיוניים לתמיכה ביישום של טיפול תאי 3,13.
בהקשר זה, הוצע ליזט טסיות דם אנושי (hPL) כתחליף ל- FBS מכיוון שהוא תוסף ללא תאים, המכיל חלבונים ומועשר בגורמי גדילה, והוא הוצג מוקדם יותר בקרב מוצרים מבוססי תאים ברמה קלינית כתוסף של מדיום גדילה לתרבית תאים חוץ גופית והרחבה14,15. מכיוון ש- hPL הוא מוצר שמקורו בבני אדם, הוא משמש לעתים קרובות כתחליף ל- FBS במהלך תרבית החוץ גופית של hASCs המיועדים ליישומים קליניים, ובכך מפחית בעיות לגבי תגובות אימונולוגיות וזיהומים הקשורים לתרגום FBS15,16.
למרות עלויות הייצור הגבוהות יותר, כבר הוכח כי בהשוואה ל- FBS, hPL תומך בכדאיות התא עבור סוגי תאים רבים, מגביר את ההתפשטות, מעכב הזדקנות, מבטיח יציבות גנומית ומשמר את האימונופנוטיפ התאי גם במעברי תאים מאוחרים; כל המרכיבים הללו תומכים במעבר למוסף תרבות זה11.
מטרת העבודה הזו הייתה לפתח פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ולתרבית של hASCs בשיטה מלאה נטולת בעלי חיים, מבלי לשנות את הפיזיולוגיה של התא ואת תכונות הגבעול בהשוואה ל-hASCs קלאסיים בתרבית FBS (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי גזע שמקורם בשומן משכו את העניין של מחקר תרגומי בעשור האחרון בשל השפע שלהם, שיטות בידוד מהירות ובמחיר סביר, שיעור גבוה של ריבוי מבחנה / in vivo, ותכונות גזע / התמיינות18,19,20. כתוצאה מכך, hASCs נחשבים מועמדים מצוינים לאסטרטגיות מבוססות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
למחברים אין הכרות.
Materials
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | – | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | – | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
