Summary

Standardizzazione di un test citometrico a perline basato su anticorpi tuorlo d'uovo

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo descrive una metodologia per la preparazione di perle di lattice per saggi che utilizzano anticorpi IgY per la rilevazione dell’antigene.

Abstract

I dosaggi immunologici sono test importanti per l’individuazione di numerosi bersagli molecolari. Tra i metodi attualmente disponibili, il test citometrico a microsfere ha guadagnato importanza negli ultimi decenni. Ogni microsfera che viene letta dall’apparecchiatura rappresenta un evento di analisi della capacità di interazione tra le molecole in prova. Migliaia di questi eventi vengono letti in un unico saggio, garantendo così un’elevata precisione e riproducibilità del saggio. Questa metodologia può essere utilizzata anche nella validazione di nuovi input, come gli anticorpi IgY, per la diagnosi di malattie. Questi anticorpi si ottengono immunizzando i polli con l’antigene di interesse e quindi estraendo l’immunoglobulina dal tuorlo delle uova degli animali; Pertanto, questo è un metodo indolore e altamente produttivo per ottenere gli anticorpi. Oltre a una metodologia per la validazione ad alta precisione della capacità di riconoscimento degli anticorpi di questo test, questo documento presenta anche un metodo per estrarre questi anticorpi, determinare le migliori condizioni di accoppiamento per gli anticorpi e le perle di lattice e determinare la sensibilità del test.

Introduction

Tra le tecniche di immunodosaggio finalizzate alla diagnosi delle malattie, il test citometrico a microsfere è emerso come un approccio altamente sensibile e affidabile, poiché consente l’analisi di migliaia di particelle in un unico test1. Questa tecnica, oltre ad avere un’elevata produttività e a consentire l’utilizzo di volumi minori di campioni, presenta anche una grande flessibilità, poiché consente la rilevazione di diverse molecole, come citochine, molecole di adesione, isotipi di anticorpi e proteine 2,3.

Per lo sviluppo di questi saggi vengono utilizzate diverse particelle, tra cui le perle di lattice, che sono un input efficace e a basso costo. Questi possono presentare modificazioni sulla loro superficie, come la presenza di gruppi funzionali o proteine che permettono l’accoppiamento covalente o non covalente di alcune molecole 3,4,5.

Questi test immunologici utilizzano componenti come antigeni e anticorpi per eseguire il rilevamento di marcatori di malattia e richiedono comunemente anticorpi da mammiferi come topi, conigli e capre. Questo crea problemi legati a questioni etiche, poiché l’immunizzazione dei mammiferi richiede generalmente molti animali per ottenere una buona resa, nonché la frequente esecuzione di procedure che portano alla sofferenza degli animali 6,7. Un’alternativa a questo è l’uso di anticorpi IgY isolati dai tuorli d’uovo di polli immunizzati, poiché nei tuorli si possono trovare alte concentrazioni di anticorpi specifici contro gli antigeni inoculati; La produzione di un pollo equivale alla produzione di 4,3 conigli nel corso di un anno 6,7.

Pertanto, l’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un metodo per valutare gli anticorpi IgY ottenuti da tuorli d’uovo di gallina utilizzando la citometria a flusso con perline di lattice. Per questo, proponiamo un metodo di standardizzazione per un test immunologico citometrico a microsfere in formato sandwich utilizzando perle di lattice. Come modello, abbiamo utilizzato anticorpi IgY diretti contro l’antigene della proteina II ricca di istidina del Plasmodium falciparum (IgY-PfHRP2). Descriviamo un metodo per l’estrazione degli anticorpi, discutiamo i passaggi critici per definire la concentrazione di accoppiamento di questi alle perle di lattice e presentiamo una valutazione del limite di rilevazione dell’antigene. L’elevata precisione della citometria a flusso, unita al basso costo delle perle di lattice, rendono questa tecnica applicabile per l’analisi di strumenti di immunoanalisi, come anticorpi e antigeni. Questo metodo può essere utilizzato per il rilevamento di diversi obiettivi.

Protocol

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. 1. Estrazione delle IgY dai tuorli d’uovo Igienizzazione delle uovaImmergere le uova (appena deposte o fino a 4 giorni dopo la deposizione, del lignaggio Gallus gallus Dekalb White) in una soluzione diluita allo 0,2% di ipoclorito di sodio, sciacquare rapidamente sotto l’acqua corrente e strof…

Representative Results

La Figura 2 fornisce una rappresentazione grafica del processo di estrazione degli anticorpi IgY tramite acidificazione, seguita da separazione mediante acido caprilico (Figura 2). Figura 2: Rappresentazione schematica della fase di estrazione degli anticorpi IgY…

Discussion

Il metodo di precipitazione dell’anticorpo IgY mediante riduzione del pH seguita da separazione lipidica mediante acido caprilico è efficiente nell’isolare gli anticorpi totali senza alcuna perdita di funzionalità. Il metodo qui proposto è più semplice ed economico di quello riportato da Redwan et al.11, che utilizzava anch’esso la precipitazione per acidificazione e acido caprilico ma con un protocollo più complesso e laborioso. Questo metodo presenta anche vantaggi rispetto alle metodologie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), il Programma post-laurea in Biotecnologie (PPGBIOTEC presso l’Universidade Federal do Amazonas – UFAM), il Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) e la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) per aver fornito le borse di studio. La Figura 2 e la Figura 4 sono state create con biorender.com.

Materials

Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

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Cite This Article
Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

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