Summary

סטנדרטיזציה של בדיקת חרוזים ציטומטרית המבוססת על נוגדנים לחלמון ביצה

Published: May 19, 2023
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להכנת חרוזי לטקס לבדיקות באמצעות נוגדני IgY לזיהוי אנטיגן.

Abstract

בדיקות חיסוניות הן בדיקות חשובות לזיהוי מטרות מולקולריות רבות. בין השיטות הקיימות כיום, בדיקת החרוזים הציטומטריים זכתה לבולטות בעשורים האחרונים. כל מיקרוספירה שנקראת על ידי הציוד מייצגת אירוע ניתוח של יכולת האינטראקציה בין המולקולות הנבדקות. אלפי אירועים אלה נקראים בבדיקה אחת, ובכך מבטיחים דיוק ושחזור גבוהים של הבדיקה. מתודולוגיה זו יכולה לשמש גם באימות של תשומות חדשות, כגון נוגדנים IgY, לאבחון מחלות. נוגדנים אלה מתקבלים באמצעות חיסון תרנגולות עם האנטיגן של עניין ולאחר מכן חילוץ אימונוגלובולין מן החלמון של ביצים של בעלי חיים; לכן, זוהי שיטה ללא כאבים ופרודוקטיבית מאוד להשגת הנוגדנים. בנוסף למתודולוגיה לאימות מדויק של יכולת זיהוי הנוגדנים של בדיקה זו, מאמר זה מציג גם שיטה לחילוץ נוגדנים אלה, קביעת תנאי הצימוד הטובים ביותר עבור הנוגדנים וחרוזי הלטקס, וקביעת רגישות הבדיקה.

Introduction

בין טכניקות immunoassay שמטרתן לאבחן מחלות, בדיקת החרוזים הציטומטרית התפתחה כגישה רגישה ואמינה ביותר, שכן היא מאפשרת ניתוח של אלפי חלקיקים בבדיקה אחת1. טכניקה זו, בנוסף לפרודוקטיביות גבוהה ומאפשרת שימוש בכמויות קטנות יותר של דגימות, מציגה גם גמישות רבה, שכן היא מאפשרת זיהוי של מספר מולקולות, כגון ציטוקינים, מולקולות הידבקות, איזוטיפים נוגדנים וחלבונים 2,3.

חלקיקים שונים משמשים לפיתוח בדיקות אלה, ביניהם חרוזי לטקס, המהווים תשומה יעילה וזולה. אלה יכולים להציג שינויים על פני השטח שלהם, כגון נוכחות של קבוצות פונקציונליות או חלבונים המאפשרים צימוד קוולנטי או לא קוולנטי של מולקולות מסוימות 3,4,5.

בדיקות חיסוניות אלה משתמשות ברכיבים כגון אנטיגנים ונוגדנים כדי לבצע זיהוי של סמני מחלה ובדרך כלל דורשות נוגדנים מיונקים כגון עכברים, ארנבות ועזים. זה יוצר בעיות הקשורות לסוגיות אתיות, שכן חיסון של יונקים בדרך כלל דורש בעלי חיים רבים כדי להשיג תשואה טובה, כמו גם את הביצועים התכופים של נהלים המובילים לסבל של בעלי חיים 6,7. חלופה לכך היא שימוש בנוגדני IgY שבודדו מחלמוני הביצה של תרנגולות מחוסנות, שכן ניתן למצוא בחלמונים ריכוזים גבוהים של נוגדנים ספציפיים כנגד האנטיגנים המחוסנים; הייצור של עוף שווה לייצור של 4.3 ארנבות במהלך שנה 6,7.

לפיכך, מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה להערכת נוגדני IgY המתקבלים מחלמוני ביצת תרנגולת באמצעות ציטומטריית זרימה עם חרוזי לטקס. לשם כך, אנו מציעים שיטת סטנדרטיזציה עבור immunoassay חרוז ציטומטרי בפורמט סנדוויץ’ באמצעות חרוזי לטקס. כמודל, השתמשנו בנוגדני IgY המכוונים לאנטיגן Plasmodium falciparum histidine-עשיר בחלבון II (IgY-PfHRP2). אנו מתארים שיטה לחילוץ הנוגדנים, דנים בשלבים הקריטיים להגדרת ריכוז הצימוד שלהם לחרוזי הלטקס, ומציגים הערכה של גבול הזיהוי של האנטיגן. הדיוק הגבוה של ציטומטריית זרימה, יחד עם העלות הנמוכה של חרוזי לטקס, הופכים טכניקה זו לישימה לניתוח כלים חיסוניים, כגון נוגדנים ואנטיגנים. שיטה זו יכולה לשמש לאיתור מטרות מגוונות.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. 1. מיצוי IgY מחלמונים היגינזציה של הביציםיש לטבול את הביצים (טריות שהוטלו או עד 4 ימים לאחר ההטלה, משושלת Gallus gallus Dekalb White) בתמיסה מדוללת 0.2% של נת?…

Representative Results

איור 2 מספק ייצוג גרפי של תהליך מיצוי נוגדני IgY באמצעות החמצה, ואחריו הפרדה באמצעות חומצה קפרילית (איור 2). איור 2: ייצוג סכמטי של שלב מיצוי נוגדני IgY…

Discussion

שיטת המשקעים של נוגדן IgY על ידי הפחתת pH ואחריה הפרדת שומנים באמצעות חומצה קפרילית יעילה בבידוד סך הנוגדנים ללא כל אובדן פונקציונליות. השיטה המוצעת כאן פשוטה וזולה יותר מזו שדווחה על ידי Redwan et al.11, שהשתמשו גם במשקעים על ידי החמצה וחומצה קפרילית אך עם פרוטוקול מורכב ומייגע יותר. ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ל- FIOCRUZ (“Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane – ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA”), לתוכנית לתואר שני בביוטכנולוגיה (PPGBIOTEC באוניברסיטה הפדרלית של אמזונס – UFAM), ל- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES), ול- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) על מתן המלגות. איור 2 ואיור 4 נוצרו עם biorender.com.

Materials

Anti-Chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed, CF 488A antibody produced in donkey Sigma-Aldrich SAB4600031
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab′)2 Sigma-Aldrich SAB4600388
BD FACSCanto II BD Biosciences BF-FACSC2
BD FACSDiva CS&T research beads (CS&T research beads) BD Biosciences 655050
BD FACSDiva software 7.0 BD Biosciences 655677
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
Caprilic acid Sigma-Aldrich O3907
Centrifuge 5702 R Eppendorf Z606936
Chloride 37% acid molecular grade NEON 02618 NEON
CML latex, 4% w/v Invitrogen C37253
Megafuge 8R Thermo Scientific TS-HM8R
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride Powder (EDC) Sigma-Aldrich E7750-1G
N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich 130672-25G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich 1003335620
Sodium hydroxide Acs Cientifica P.10.0594.024.00.27
Sodium hypochlorite Acs Cientifica R09211000
Thermo Mixer Heat/Cool KASVI K80-120R

References

  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407 (2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49 (2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956 (2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084 (2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986 (2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Play Video

Cite This Article
Corrêa Glória, J., Oliveira Chaves, Y., Marques de Figueiredo, A., Coutinho de Souza, C., Duarte da Silva, E. R., Lopes Batista, J. C., Nogueira, P. A., Morais Mariúba, L. A. Standardization of a Cytometric Bead Assay Based on Egg-Yolk Antibodies. J. Vis. Exp. (195), e65123, doi:10.3791/65123 (2023).

View Video