Summary
Le protocole résume les pratiques exemplaires pour minimiser la charge microbienne dans un environnement de salle blanche et comprend des stratégies telles que la surveillance environnementale, la surveillance des procédés et les tests de stérilité des produits. Elle est pertinente pour les installations de fabrication et d’essai qui sont tenues de respecter les normes actuelles de bonnes pratiques tissulaires et les normes actuelles de bonnes pratiques de fabrication.
Abstract
Un programme holistique et bien validé qui intègre de solides mesures de habillage, de nettoyage, de surveillance environnementale et de surveillance du personnel est essentiel pour minimiser la charge microbienne dans les salles de fabrication de thérapies cellulaires et les laboratoires d’essais correspondants afin de s’assurer que les installations fonctionnent dans un état de contrôle. Assurer la sécurité des produits au moyen de mesures de contrôle de la qualité, comme les tests de stérilité, est une exigence réglementaire pour les cellules, les tissus et les produits cellulaires et tissulaires (HCT/Ps) manipulés de façon minimale (article 361) et plus que les produits à manipulation minimale (article 351). Dans cette vidéo, nous fournissons un guide par étapes sur la façon de développer et d’intégrer les meilleures pratiques aseptiques pour fonctionner dans un environnement de salle blanche, y compris l’habillage, le nettoyage, la mise en scène des matériaux, la surveillance environnementale, la surveillance des processus et les tests de stérilité des produits par inoculation directe, fournis par la United States Pharmacopeia (USP<71>) et la méthode alternative de test de stérilité des National Institutes of Health (NIH). Ce protocole se veut un guide de référence pour les établissements qui doivent respecter les bonnes pratiques tissulaires actuelles (BPTc) et les bonnes pratiques de fabrication (BPFc).
Introduction
La mise en œuvre d’un solide programme de surveillance microbienne au moyen de la surveillance environnementale (ME), de la surveillance des procédés et des tests de stérilité des produits est une exigence réglementaire pour les bonnes pratiques tissulaires actuelles (BPTc) et les bonnes pratiques de fabrication actuelles (BPFc) dans les laboratoires de thérapie cellulaire1. De plus, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis s’attend à ce que le laboratoire effectuant les tests de contrôle de la qualité (CQ) du produit utilise également des installations et des contrôles comparables à ceux utilisés pour les opérations de remplissage aseptique2.
Ce protocole comporte quatre sections principales : 1) les pratiques aseptiques, y compris l’habillage, le nettoyage et la mise en scène des matériaux; 2) EM, y compris les cultures viables dans l’air et la surface et la surveillance de l’air par particules non viables; 3) la surveillance des procédés, y compris les plaques de décantation et l’échantillonnage du bout des doigts gantés; et 4) les tests de stérilité des produits effectués selon la méthode3 officinale de la United States Pharmacopeia (USP) <71> oula méthode 4 des tests de stérilité alternative des NIH. Lorsqu’elles sont utilisées ensemble, ces mesures peuvent constituer une méthode efficace pour s’assurer qu’une installation demeure sous contrôle.
Les techniques décrites ici ne sont pas nouvelles; Cependant, les normes actuelles des organismes de réglementation et des organisations professionnelles manquent de détails, ce qui a entraîné une absence de surveillance microbienne ou la mise en œuvre de pratiques non normalisées, en particulier dans les centres universitaires où la fabrication sur place et les tests de stérilité des produits émergent à un rythme rapide 1,5,6 . Ce protocole peut servir de guide pour créer un programme de surveillance et de contrôle microbiens qui répond aux exigences réglementaires lorsqu’il est utilisé conjointement avec la validation par l’utilisateur final et l’évaluation des risques.
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Protocol
1. Pratiques aseptiques
- Personnel à la recherche d’un espace pour salle blanche
NOTE: Cette procédure est basée sur l’habillage initial dans un espace non classifié, suivi de l’entrée dans une zone de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) 8, puis dans une zone ISO7. Cette procédure est pertinente pour les laboratoires qui tentent de convertir un espace existant en salle blanche. Idéalement, tous les habillages initiaux devraient avoir lieu dans un espace classé ISO8 (et non dans un espace non classé).- Sécurisez les cheveux lâches. Lavez-vous les mains et changez-vous en gommages (les hauts à ruban à manches longues et les pantalons de gommage longs sont préférables). Rassemblez-vous et enfilez des chaussures de salle blanche avec des couvre-chaussures.
- Désinfectez les mains à l’aide d’un désinfectant pour les mains à base d’alcool au début, puis de nouveau entre chacune des étapes suivantes : enfiler des gants non stériles, puis une housse de barbe (pour toute quantité de poils faciaux visibles), le cas échéant. Enfilez un bouffant non stérile et couvrez les avant-bras avec des manches non stériles si vous n’avez pas utilisé de hauts à récurer à manches longues.
- Retirez les couvre-chaussures, en marchant sur le tapis collant devant la porte de l’antichambre ISO8 avec chaque pied après le retrait de la housse de chaussure. Assurez-vous que tout le pied entre en contact avec le tapis collant avant d’entrer. Jetez les couvre-chaussures et décontaminez les gants et la poignée de porte avec de l’alcool isopropylique stérile à 70 % (sIPA). Entrez dans l’antichambre ISO8.
- Rassemblez une cagoule stérile, un masque facial stérile, une combinaison stérile, des couvre-bottes stériles et des lunettes de sécurité. Décontaminez les gants avec 70% de sIPA. Enfilez des lunettes de sécurité et mettez les matériaux en scène sur une surface propre, conformément à l’étape 1.5.
- Enfilez une nouvelle paire de couvre-chaussures non stériles par-dessus les chaussures dédiées à la salle blanche et montez sur le tapis collant devant l’antichambre secondaire. Assurez-vous que l’intégralité de chaque pied entre en contact avec le tapis collant. Décontaminez les gants avec 70% de sIPA. Rassemblez les fournitures d’habillage mises en scène et entrez dans l’antichambre secondaire ISO7, en restant du côté sale de la ligne de démarcation.
- Enfilez la capuche stérile et la combinaison stérile, en ne touchant que l’intérieur du matériau d’habillage et en veillant à ce que le col de la capuche soit rentré à l’intérieur de la combinaison pour créer une étanchéité complète. Enfilez les couvercles secondaires stériles des bottes. Décontaminez les gants avec 70% de sIPA entre chaque étape d’enfilage.
- Vérifiez que l’habillage a été enfilé correctement, décontaminez les gants avec 70% de sIPA et entrez dans l’espace ISO7.
REMARQUE : Inspectez périodiquement le matériel d’habillage pour en vérifier l’intégrité. En cas de compromis, quittez immédiatement la salle blanche et redressez-vous.
- Enfiler une enceinte de sécurité biologique (ESB)
- Robe selon l’étape 1.1 ci-dessus avec ces pratiques supplémentaires.
- Rassemblez des gants stériles et des manches stériles. Nettoyez l’ESB conformément à l’étape 1.4 et mettez en scène les matériaux conformément à l’étape 1.5. Décontaminez les gants avec 70% de sIPA.
- Enfiler de manière aseptique des manches stériles sur la combinaison, en utilisant des boucles de pouce si présentes. Enfilez des gants stériles par-dessus les gants existants, en veillant à ce que le poignet du gant s’étende sur la manche stérile. Décontaminez les gants avec 70% de sIPA entre chaque étape. Entrez le BSC.
REMARQUE : Inspectez périodiquement le matériel d’habillage pour en vérifier l’intégrité. En cas de compromis, quittez immédiatement la salle blanche et redressez-vous.
- Enlèvement des matériaux d’habillage
- Sortez de l’ESB et retirez délicatement la paire supérieure de gants et les manches stériles. Décontaminez les gants intérieurs avec 70% de sIPA.
- Entrez dans l’antichambre secondaire, puis primaire, en attendant que la porte se ferme complètement entre chaque étape. Retirez les matériaux dans l’ordre suivant : couvre-bottes stériles extérieurs, combinaison, capuche et masque facial.
- Sortez de l’antichambre primaire et retirez le vêtement non stérile.
NOTE: L’ordre de retrait dans l’espace non classé n’est pas important; Cependant, les couvre-chaussures intérieurs non stériles doivent rester sur les chaussures de salle blanche pour être stockés dans des espaces non classés. - Désinfectez les mains à l’aide d’un désinfectant pour les mains à base d’alcool et retournez aux vêtements de ville.
- Nettoyage des surfaces de la salle blanche et de l’ESB
- Assemblez une vadrouille de nettoyage portative ou procurez-vous une lingette propre à faible peluche. Si vous utilisez une lingette à peluches faibles, pliez la lingette en quartiers et faites-la pivoter entre chaque surface. Saturer la tête de vadrouille ou la lingette à peluches faibles avec un désinfectant approuvé.
- En travaillant de l’arrière vers l’avant (ou de haut en bas), nettoyez l’ESB à l’aide de lingettes qui se chevauchent dans l’ordre suivant : la grille du diffuseur HEPA (le haut de l’ESB), la paroi arrière de l’ESB, les deux parois latérales de l’ESB, le châssis et la surface de travail. Enfin, essuyez le châssis de l’ESB à l’aide de 70 % de sIPA pour éliminer tout désinfectant résiduel. Reportez-vous à la figure 1 pour connaître un modèle de nettoyage typique de l’ESB.
- Classement du matériel et de l’équipement dans des environnements classifiés
- Décontaminer (c.-à-d. mettre en scène) tous les matériaux nécessitant un transfert d’une zone non classifiée ou d’une zone classée moins bien à une zone classée plus élevée (p. ex., d’un espace ISO8 à un espace ISO7) afin de minimiser le transfert de microbes. Le transfert de matériaux entre zones d’un même niveau de classification ISO ne nécessite pas de mise en scène.
NOTA : Si les matériaux ont été stérilisés en phase terminale et sont dans plusieurs sacs, retirer le sac ou la pochette extérieure et déplacer le matériel dans l’espace classifié; Il n’est pas nécessaire d’essuyer le sac/sachet interne. - Procurez-vous une lingette à peluches faibles et pliez la lingette en quartiers pour la faire pivoter sur un côté propre lorsque la lingette devient souillée. Saturez la lingette avec 70% de sIPA ou un désinfectant approuvé.
- Essuyez l’extérieur du matériel ou de l’équipement à l’aide de lingettes qui se chevauchent. Assurez-vous que toutes les zones de l’article sont essuyées, y compris l’intérieur des joints d’emballage amovibles et les coins / empreintes sur l’équipement et d’autres fournitures de forme irrégulière. Pour l’équipement sur roues, assurez-vous que toute la roue a été essuyée pendant le processus de mise en scène (l’équipement peut avoir besoin d’être légèrement incliné pour permettre la rotation des roues).
- Décontaminer (c.-à-d. mettre en scène) tous les matériaux nécessitant un transfert d’une zone non classifiée ou d’une zone classée moins bien à une zone classée plus élevée (p. ex., d’un espace ISO8 à un espace ISO7) afin de minimiser le transfert de microbes. Le transfert de matériaux entre zones d’un même niveau de classification ISO ne nécessite pas de mise en scène.
Figure 1 : Exemple de modèle de nettoyage de l’ESB. En travaillant de l’arrière vers l’avant (ou de haut en bas), nettoyez l’ESB à l’aide de lingettes qui se chevauchent dans l’ordre suivant : la grille du diffuseur HEPA (le haut de l’ESB), la paroi arrière de l’ESB, les deux parois latérales de l’ESB, le châssis et la surface de travail. Enfin, essuyez le châssis de l’ESB à l’aide de 70 % de sIPA pour éliminer tout désinfectant résiduel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Surveillance de l’environnement (ME)
- Échantillonnage de surface viable
- Mettre en scène les matériaux nécessaires à la séance d’échantillonnage conformément à l’étape 1.5 et les placer dans l’espace classifié conformément à la section 1.
REMARQUE : L’échantillonnage de surface doit être effectué avant l’échantillonnage de l’air à tout endroit précis. Si vous utilisez plusieurs plaques pour échantillonner une zone en surface, n’échantillonnez pas exactement le même emplacement. Utilisez des plaques de contact pour échantillonner les surfaces planes uniquement pour assurer un contact complet et éviter d’endommager la gélose potentielle. - Prélever et étiqueter une gélose tryptique à soya avec plaque de lécithinase et d’adolescent (TSALT) et une gélose au dextrose Sabouraud avec plaque de lécithinase et d’interpolation (SABLT) pour chaque site d’échantillonnage. En tenant le fond de la plaque d’une main, retirez le couvercle de manière aseptique, en prenant soin de ne pas toucher la surface de gélose surélevée.
- Touchez la gélose surélevée sur la surface échantillonnée, en vous assurant que toute la surface est en contact, et appliquez une pression ferme sur la plaque. Laissez la plaque en contact avec la surface pendant au moins 5 s.
- CRITIQUE : Ne déplacez pas la plaque latéralement sur la surface échantillonnée, car cela pourrait répartir la croissance potentielle sur la surface, ce qui rendrait difficile la résolution des colonies individuelles. N’exercez pas de force excessive sur la plaque de contact pendant l’échantillonnage, car la surface de la gélose pourrait se fissurer.
- Replacez le couvercle de manière aseptique, en prenant soin de ne pas toucher la surface surélevée de la gélose surélevée. Verrouillez le couvercle en place si la plaque de contact est équipée d’un système de verrouillage. Nettoyez la zone d’échantillonnage avec 70% de sIPA pour éliminer tout milieu résiduel de la surface. Ensacher les assiettes de manière lâche et incuber les cultures comme décrit dans le tableau 1. Une image représentative montrant la croissance de trois unités formant colonies (UFC) avec deux morphologies de colonies distinctes sur une plaque d’échantillonnage de surface TSALT est illustrée à la figure 2. La figure 3 montre la contamination d’une plaque TSALT par une croissance sur le bord de la plaque, attribuable à une mauvaise technique aseptique lors du prélèvement de l’échantillon.
- Mettre en scène les matériaux nécessaires à la séance d’échantillonnage conformément à l’étape 1.5 et les placer dans l’espace classifié conformément à la section 1.
- Échantillonnage viable de l’air
- Mettre en scène les matériaux nécessaires à la séance d’échantillonnage conformément à l’étape 1.5 et les placer dans l’espace classifié conformément à la section 1.
- Prélever et étiqueter une plaque de gélose tryptique de soya (TSA) et une plaque de gélose au dextrose Sabouraud (SAB) pour chaque site d’échantillonnage. Préparez l’échantillonneur d’air en retirant la tête de prélèvement de manière aseptique en ne saisissant que le bord extérieur pour éviter de contaminer la tête.
- En tenant la tête de prélèvement dans une main, placez aseptiquement le milieu dans le porte-plaque de l’échantillonneur. S’il y a une broche plus longue que les autres, insérez d’abord le milieu contre la broche la plus longue, puis poussez la plaque vers le bas dans les broches restantes pour fixer la plaque.
- Retirez de manière aseptique le couvercle de la plaque et placez-le sur une surface nettoyée jusqu’à ce que l’échantillonnage soit terminé. Replacez et fixez de manière aseptique la tête de prélèvement, en ne saisissant que le bord extérieur pour éviter de contaminer la tête. Répéter les étapes 2.2.2 à 2.2.4 pour le milieu restant si vous utilisez un échantillonneur d’air à plusieurs têtes.
- Placer l’échantillonneur d’air à l’emplacement d’échantillonnage, les têtes de prélèvement étant orientées dans la direction prédominante du mouvement du flux d’air. S’assurer que les gaz d’échappement de l’échantillonneur d’air non viable (si l’échantillonnage est effectué simultanément) n’interfèrent pas avec l’échantillonneur viable. Assurez-vous que l’échantillonneur d’air est réglé sur les paramètres validés et démarrez le cycle d’échantillonnage.
- Lorsque le cycle d’échantillonnage est terminé, retirer de manière aseptique la tête de prélèvement de l’échantillonneur en ne saisissant que le bord extérieur pour éviter de contaminer la tête. Tenez la tête d’échantillonnage dans une main et replacez de manière aseptique le couvercle de la plaque de gélose Retirez la plaque du porte-plaque. Ensacher les assiettes de manière lâche et incuber les cultures comme décrit dans le tableau 1.
- Désinfectez la tête d’échantillonnage et la zone autour du porte-plaque avec 70% de sIPA. Fixez de manière aseptique la tête de prélèvement, en ne saisissant que le bord extérieur. Répéter les étapes 2.2.6 et 2.2.7 pour le milieu restant si vous utilisez un échantillonneur d’air à plusieurs têtes.
REMARQUE : La figure 4 montre une culture d’échantillonnage actif de l’air de la TSA dont la croissance est causée par une tête d’échantillonnage contaminée. Inversement, la figure 5 représente une culture d’échantillonnage actif de l’air de la TSA sans croissance. Les retraits d’impact d’air de la tête d’échantillonnage peuvent être vus sur l’image.
- Échantillonnage non viable
- Effectuer une vérification du zéro sur le compteur de particules laser avant les activités d’échantillonnage pour chaque jour d’utilisation. Fixer la tête isocinétique à l’orifice de prélèvement du compteur de particules, soit directement, soit fixé à une longueur de tube selon les besoins du lieu d’échantillonnage.
- Si un tube est appliqué, utilisez un tube de courte longueur, car un tube de >1 m de long peut causer des problèmes de dénombrement des particules de ≥1 μm et peut également entraîner des courbures inutiles dans le tube. Assurez-vous que le compteur de particules est réglé sur les paramètres validés. Il est recommandé de fixer un délai d’environ 30 s pour permettre la sortie de la zone d’échantillonnage afin d’éviter toute perturbation du flux d’air pendant l’échantillonnage.
- Placez la tête isocinétique du compteur de particules laser dans l’emplacement d’échantillonnage, la tête isocinétique étant orientée vers la direction prédominante du mouvement du flux d’air. S’assurer que les gaz d’échappement de l’échantillonneur d’air viable (si l’échantillonnage est effectué simultanément) n’interfèrent pas avec l’échantillonneur non viable. Pour les zones où le flux d’air n’est pas unidirectionnel ou où le schéma de circulation de l’air est inconnu, assurez-vous que la tête isocinétique est orientée verticalement vers le haut.
REMARQUE : Si un désinfectant rotatif ou du sIPA à 70 % a été aérosolisé près de l’échantillonneur d’air, attendez au moins 5 minutes avant de commencer le cycle d’échantillonnage. - Commencez le cycle d’échantillonnage et quittez lentement la zone d’échantillonnage pour éviter de perturber le flux d’air.
CRITIQUE : Ne pas aérosoliser les liquides près de l’échantillonneur d’air pendant un cycle d’échantillonnage, car cela entraînerait des numérations non viables élevées. - Une fois l’échantillonnage terminé, récupérez le compteur de particules laser. Enregistrez le nombre moyen de particules pour 0,5 μm. Certaines installations peuvent également suivre et suivre une tendance de 5,0 μm.
- Répétez les étapes 2.3.3-2.3.6 pour le prochain emplacement d’échantillonnage. Si vous vous déplacez entre des pièces ou des ESB, essuyez l’extérieur de l’échantillonneur de particules non viable avec 70 % de sIPA ou un désinfectant approuvé. Évitez d’introduire du désinfectant à l’intérieur de la tête isocinétique, car cela pourrait entraîner un comptage inexact des particules.
| Catégorie | Média | Conditions de culture | Observation de la culture | Résultats | ||||||
| Surveillance de l’environnement | TSA (air viable) | 30 °C-35 °C, air, pendant au moins 3 jours | Fin de l’incubation | Le groupe d’assurance qualité de chaque installation devrait établir des limites d’alerte et d’intervention pour chaque type et emplacement d’échantillonnage. Les limites d’intervention pour les échantillons viables fondées sur la classification ISO peuvent être guidées à l’aide des PIC/S 009-16 (Annexes) 18 et ISO-14644-1 7. Les limites d’intervention pour les échantillons d’air non viables sont généralement fixées à un pourcentage de la limite ISO (p. ex. 99 %). Les limites d’alerte pour les échantillons viables sont généralement fixées à un pourcentage de la limite d’intervention ou de la limite ISO (p. ex. 95 %). Consulter les PDA TR-13 et USP<1116> pour plus de détails concernant l’établissement des niveaux d’alerte et d’intervention et la validation de certaines conditions d’élevage 8,9. | ||||||
| SAB (air viable) | 20 °C-25 °C, air, pendant au moins 7 jours | |||||||||
| TSALT (surface viable) | 30 °C-35 °C, air, pendant au moins 3 jours | Des images représentatives des plaques EM sont présentées à la figure 2, à la figure 3, à la figure 4 et à la figure 5. | ||||||||
| SABLT (surface viable) | 20 °C-25 °C, air, pendant au moins 7 jours | |||||||||
| Surveillance des processus | TSA (plaque de décantation) | 30 °C-35 °C, air, pendant au moins 3 jours | À titre d’information seulement. Fournit des informations utiles en cas d’enquête OOS en réponse à un test de stérilité du produit échoué. | |||||||
| SAB (plaque de décantation) | 20 °C-25 °C, air, pendant au moins 7 jours | Voir la figure 6 pour un exemple de plaque de décantation positive. | ||||||||
| Échantillonnage du bout des doigts gantés | TSALT | 30 °C-35 °C, air, pendant au moins 48 heures jours suivi de 20 °C-25 °C pendant au moins 5 jours 19. | Les critères d’acceptabilité des SFP sont de <1 UFC/plaque (c.-à-d. aucune croissance) conformément au PIC/S 009-16 (annexes) 18. Les critères d’acceptabilité peuvent être modifiés à la discrétion de l’AQ de l’établissement. | |||||||
| Test de stérilité des produits | BST (USP<71>) | 20 °C-25 °C, air, pendant au moins 14 jours | Périodiquement tout au long de la période d’incubation (jours 3, 5, 7 et 14) | Pas de croissance. | ||||||
| FTM (USP<71>) | 30 °C-35 °C, air, pendant au moins 14 jours | |||||||||
| iFA+ (méthode NIH) | 30 °C-35 °C, air, pendant au moins 14 jours | Surveillance automatique par l’instrument BacT/ALERT Dual-T. Un contrôle visuel de chaque bouteille à la fin de l’incubation pour les billes de moule est fortement recommandé. | Voir la figure 8 pour un exemple de billes de moisissure visibles qui n’ont pas été détectées automatiquement par le BacT/ALERT. | |||||||
| iFN+ (méthode NIH) | ||||||||||
| SAB (méthode NIH) | 20 °C-25 °C pendant au moins 14 jours | Périodiquement tout au long de la période d’incubation (jours 3, 5, 7 et 14) | ||||||||
Tableau 1 : Résumé des conditions de culture recommandées et des résultats attendus. Les conditions de culture décrites ici sont des recommandations basées sur un programme validé utilisé au NIH. Chaque utilisateur final est tenu de valider son propre programme d’analyses microbiologiques. Les stratégies de contrôle et d’essai microbiens peuvent différer d’un institut à l’autre en fonction de variables, notamment la conception de l’installation, la flore de l’installation et la classification des risques liés aux produits.
Figure 2 : Croissance sur la plaque TSALT. La plaque d’échantillonnage de surface TSALT montrant trois UFC de deux morphologies de colonies distinctes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Contamination de la plaque TSALT lors de la collecte. La culture de surface TSALT montre une seule colonie sur le bord de la plaque, ce qui indique une mauvaise manipulation aseptique pendant le processus d’échantillonnage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Culture obtenue à l’aide d’une tête d’échantillonnage d’air contaminé. Exemple d’une culture d’échantillonnage actif de l’air de la TSA montrant > 100 unités formant colonies (UFC) de morphologies mixtes. Le schéma de croissance indique une contamination de la tête de prélèvement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Aucune croissance sur une plaque d’air viable active TSA. Plaque d’air viable active TSA n’illustrant aucune croissance après l’incubation. Les retraits de la tête active de l’échantillonneur d’air sont visibles dans l’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Surveillance des processus
- Plaques de décantation (surveillance passive de l’air)
- Placez les plaques TSA et SAB étiquetées près de la zone de travail, mais dans une zone qui n’interférera pas avec les tests. Documenter l’heure de début de l’échantillonnage et ouvrir les deux plaques de façon aseptique, en plaçant les couvercles sur une surface propre dans l’ESB, loin de la zone de travail.
- Les plaques de décantation peuvent être ouvertes pendant une durée maximale de 4 h pour éviter le dessèchement de la gélose. Fermez les couvercles des plaques à la fin du traitement. Ensacher les assiettes de manière lâche et incuber les cultures comme décrit dans le tableau 1. La figure 6 montre un contaminant à une seule colonie sur une plaque de décantation de l’air TSA.
- Échantillonnage du bout des doigts gantés (GFS)
- Procurez-vous deux plaques TSALT étiquetées. Retirez de manière aseptique le couvercle d’une plaque et placez-la sur une surface de travail propre, loin de la zone d’échantillonnage.
- Roulez doucement le coussinet de chaque doigt et le pouce d’une main sur la surface de la plaque (Figure 7). Échantillonnez la plus grande surface de chaque doigt / pouce plutôt que la pointe. Utilisez une force suffisante pour faire de légères dépressions sur la gélose sans fissurer la surface de la gélose.
- Replacez le couvercle de manière aseptique sur la plaque et répétez l’étape 3.2.2 pour l’autre main. Désinfecter les mains avec 70% de sIPA à la fin de l’échantillonnage. Ensacher les assiettes de manière lâche et incuber les cultures comme décrit dans le tableau 1.
Figure 6 : Croissance sur une plaque de décantation d’air TSA. Une plaque de décantation de l’air TSA illustrant une seule colonie d’un contaminant cultivé lors de la surveillance passive du processus d’air dans l’ESB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Échantillonnage du bout des doigts gantés. La méthode correcte pour obtenir des échantillons du bout des doigts gantés en utilisant la plus grande surface (ou coussinet) de chaque doigt / pouce est indiquée à gauche. Le processus incorrect où seul le bout du doigt est échantillonné est indiqué à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Essais de stérilité par inoculation directe du produit
- Inoculation directe après USP<71>
- Obtenir un flacon de bouillon de soya tryptique (BST) étiqueté et un flacon de thioglycolate liquide (FTM) étiquetés pour chaque article soumis à l’essai. Pour la séance d’essai, obtenir un TSALT et un SABLT pour l’échantillonnage de surface viable, un TSA et une plaque SAB pour les plaques de décantation et deux plaques TSALT pour GFS.
- Blouse pour le travail à l’intérieur de l’ESB conformément à l’étape 1.2. Nettoyez l’ESB conformément à l’étape 1.4. Mettez les matières en scène dans l’ESB conformément à l’étape 1.5. Effectuer un échantillonnage par contact de la zone de travail critique conformément à l’étape 2.1, en essuyant la surface avec 70 % de sIPA après l’échantillonnage. Préparer les plaques de décantation TSA et SAB près de la zone de travail conformément à l’étape 3.1.
- Procurez-vous l’article d’essai et les flacons TSB et FTM associés. Si les flacons TSB et FTM ont un septum, retirez les bouchons protecteurs de chaque flacon et essuyez le septum avec une lingette éthylométrique stérile. Si les bouteilles TSB et FTM ont un bouchon à vis, desserrez le bouchon des bouteilles (mais ne retirez pas le bouchon).
- Vortex l’article d’essai pour assurer une suspension homogène. Inoculer les flacons avec le volume validé de l’article d’essai (jusqu’à 10 mL/flacon) à l’aide d’une seringue stérile et d’une aiguille hypodermique (pour les bouchons de septum) ou d’une pipette (pour les bouchons à vis).
- Après l’inoculation, essuyez le septum avec une lingette alcoolisée stérile et insérez une unité de ventilation stérile pour permettre l’échange d’air pendant l’incubation. Pour les bouteilles à bouchon vissé, fermez la bouteille, mais laissez le bouchon de 1/4 à 1/2 tour lâche pour permettre un échange d’air pendant l’incubation. Répéter les étapes 4.1.3 à 4.1.5 pour chaque objet d’essai à tester au cours de cette session.
- Fermer de manière aseptique les plaques de décantation TSA et SAB et documenter l’heure de fin de l’échantillonnage. Effectuez GFS conformément à l’étape 3.2, en essuyant les gants avec 70% de sIPA après l’échantillonnage. Ensacher les assiettes de manière lâche et incuber les cultures comme décrit dans le tableau 1.
- Transférer tout le matériel d’essai hors de l’ESB et nettoyer l’ESB conformément à l’étape 1.4.
- Inoculation directe suivant la méthode alternative de test de stérilité des NIH
- Procurez-vous une plaque étiquetéei FA+, une plaque étiquetée iFN+ et une plaque SAB pour chaque article testé. Pour la séance d’essai, obtenir un TSALT et un SABLT pour l’échantillonnage de surface viable, un TSA et une plaque SAB pour les plaques de décantation et deux plaques TSALT pour GFS.
- Blouse pour le travail à l’intérieur de l’ESB conformément à l’étape 1.2. Nettoyez l’ESB conformément à l’étape 1.4. Mettez les matières en scène dans l’ESB conformément à l’étape 1.5. Effectuer un échantillonnage par contact de la zone de travail critique conformément à l’étape 2.1, en essuyant la surface avec 70 % de sIPA après l’échantillonnage. Préparer les plaques de décantation TSA et SAB près de la zone de travail conformément à l’étape 3.1.
- Procurez-vous l’article d’essai et la plaque i FA+, iFN+ et SAB associée. Retirez les bouchons de protection des flacons i FA+ et iFN+ et essuyez le septum avec une lingette imbibée d’alcool stérile.
- Vortex l’article d’essai pour assurer une suspension homogène. Inoculer les flacons avec le volume validé de l’article d’essai (jusqu’à 10 mL/flacon) à l’aide d’une seringue stérile et d’une aiguille hypodermique. Essuyez le septum avec une lingette alcoolisée stérile après l’inoculation. Incuber les flacons sur l’instrument BacT/ALERT Dual-T comme décrit dans le tableau 1.
- À l’aide d’un pipeteur, inoculer la plaque SAB avec la quantité validée de l’article d’essai (pas plus de 500 μL/plaque) et tracer pour l’isolement à l’aide d’une boucle stérile. Laisser reposer pendant 10 minutes pour s’assurer que l’échantillon ne coule pas sur le couvercle de la plaque lorsqu’il est retourné pour l’incubation. Placer chaque plaque SAB inoculée avec l’article d’essai dans un sac en plastique, attacher lâchement et incuber comme décrit dans le tableau 1.
- Fermer de manière aseptique les plaques de décantation TSA et SAB et documenter l’heure de fin de l’échantillonnage. Effectuer le GFS comme décrit à l’étape 3.2, en essuyant les gants avec 70% de sIPA après l’échantillonnage. Ensacher les assiettes de manière lâche et incuber les cultures comme décrit dans le tableau 1. L’inspection visuelle des flacons de BacT/ALERT à la fin de la période d’incubation est essentielle pour détecter les billes de moisissure qui n’ont peut-être pas été détectées par l’instrument (Figure 8).
- Transférer tout le matériel d’essai hors de l’ESB et nettoyer l’ESB conformément à l’étape 1.4.
Figure 8 : Croissance de moisissures qui n’ont pas été détectées par le BacT/ALERT. Exemple de boules de moisissure, visibles à l’œil nu, qui n’ont pas été détectées automatiquement par le système BacT/ALERT. Sur la base de ces résultats, nous recommandons l’inspection visuelle terminale de toutes les bouteilles de BacT / ALERT et l’ajout de la plaque SAB pour la culture fongique en utilisant la méthode de test de stérilité alternative des NIH. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Les résultats attendus sont décrits au tableau 1. Les données sur la ME devraient être examinées et suivies d’une enquête et d’une réponse appropriées aux actions, aux alertes ou aux écarts de limite ISO. Si une excursion se produit pour des particules non viables, il faut procéder conformément à la norme ISO 14644-Annexe A, section A.5.57. Si l’excursion peut être attribuée à un événement anormal immédiatement identifiable, les résultats de l’échantillonnage original doivent être documentés, une note doit être ajoutée pour ne pas tenir compte des résultats originaux et une description détaillée de l’événement anormal doit être fournie. Un autre échantillon peut être prélevé sur le site en question. Si l’excursion ne peut être attribuée à un événement anormal immédiatement identifiable, documenter le résultat de l’échantillonnage. Prélever un autre ensemble d’échantillons non viables sur le site en question immédiatement après avoir identifié le résultat hors spécification (OOS). Cela peut être utilisé dans le cadre de l’enquête. Conformément à la norme ISO 14644-Annexe A, section A.5.6, enquêter sur la découverte de la SOS et corriger la cause fondamentale identifiée.
Un essai de stérilité du produit échoué entraînera la turbidité de la culture USP<71> ou la croissance dans les bouteilles de BacT/ALERT et/ou la plaque SAB (figure 8). L’organisme doit être identifié au niveau de l’espèce et des essais de sensibilité appropriés doivent être effectués, si cela est cliniquement justifié. Une enquête doit être effectuée par le laboratoire d’essai pour déterminer si le résultat du SOS est valide ou s’il y a eu une erreur de laboratoire potentielle qui aurait pu contribuer au SOO. Il est fortement recommandé de tester l’échantillon de rétention. La décision de suspendre ou de libérer le produit pour perfusion doit être prise par l’équipe de soins cliniques du patient et par l’équipe de fabrication, de microbiologie, de maladies infectieuses, d’assurance de la qualité et des affaires réglementaires. Pour les HCT/P qui peuvent avoir déjà été perfusés sur la base d’essais préliminaires en cours de fabrication, le patient doit être surveillé attentivement et un rapport d’événement doit être soumis à l’organisme de réglementation approprié.
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Discussion
Ce protocole comporte plusieurs domaines critiques, notamment le maintien de la technique aseptique et du flux d’air unidirectionnel dans les salles blanches et les ESB. Les meilleures pratiques comprennent le déplacement lent et délibéré pour minimiser les turbulences. Les manipulations aseptiques doivent être effectuées du côté du produit, et non d’en haut. Le traitement en système fermé et l’utilisation de matières premières stérilisées au stade terminal sont recommandés. Il faut éviter de parler dans des zones critiques et de s’appuyer contre des murs ou des équipements. De même, il faut éviter de toucher inutilement des articles non stériles et de ramasser des objets tombés jusqu’à ce que le traitement stérile soit terminé. Les matériaux contenus dans l’ESB doivent être disposés de manière à empêcher le blocage du flux d’air et à maintenir un mouvement unidirectionnel de propre à sale. Les mouvements de l’opérateur à l’intérieur et à l’extérieur de l’ESB devraient être réduits au minimum. La documentation de toutes les activités, y compris les numéros de lot, les dates d’expiration, les dates d’étalonnage, les heures de début et de fin et le personnel d’essai pour tous les matériaux, l’équipement et les processus au cours d’une séance d’échantillonnage ou d’essai, est également essentielle.
La procédure EM décrite ici repose sur l’incubation manuelle et le comptage des colonies. La conception d’un programme de SE est à la discrétion de l’utilisateur final. Les lieux d’échantillonnage et la fréquence des tests doivent être guidés par le rapport technique PDA 138 et justifiés par une évaluation des risques qui intègre le flux de travail du laboratoire, la proximité du produit, la criticité du site, la durée et le nombre de personnes pour chaque étape8 du flux de travail. Un programme de GU typique devrait intégrer les particules atmosphériques totales (particules non viables de 0,5 μm), l’échantillonnage viable de l’air (1 000 L) et l’échantillonnage de surface viable prélevé dans des conditions dynamiques à une fréquence fondée sur les risques liés au produit et les tendances historiques. Un échantillonnage hebdomadaire est généralement recommandé pour les nouvelles installations jusqu’à ce que des tendances suffisantes en matière de données aient été établies. Des directives générales sur les conditions de SE et d’élevage sont fournies dans le tableau 1 et dans l’USP<1116>9; cependant, d’autres ont évalué différentes conditions de culture, telles que le milieu limité à la TSA/TSALT seulement, et différentes températures d’incubation, y compris les températures doubles10,11. Les instruments EM automatisés qui combinent l’incubation avec la lecture de plaques de comptage des colonies sont couramment utilisés sur le marché pharmaceutique comme méthodes rapides 8,12. Le programme de SE choisi doit être validé et dépend généralement de la flore de l’installation, de la capacité de l’incubateur, du volume de tests et de la capacité du personnel. De plus, un programme de GU établi devrait avoir un cycle de vie actif, avec des ajustements pertinents apportés aux sites de collecte, à la fréquence des tests et/ou aux limites d’alerte ou d’intervention en fonction d’un examen annuel et d’une évaluation des risques fondée sur les données8. Des changements majeurs dans les tendances en matière de GSE pourraient déclencher la réévaluation du programme de nettoyage. Les désinfectants doivent être validés au moyen d’une étude d’efficacité du désinfectant utilisant des surfaces de matériaux représentatives par rapport à la flore de l’installation pendant le temps de contact prescrit, tel que décrit dans l’USP<1072>13. Les désinfectants typiques peuvent inclure Vesphene III (temps de contact: 10 min), LpH III (temps de contact: 10 min) et un agent sporicide tel que Peridox RTU (temps de contact: 5 min). En ce qui concerne les pratiques exemplaires, les désinfectants devraient faire l’objet d’une rotation mensuelle, et les sorties, les connexions mécaniques et les surfaces de travail qui se trouvent sous l’équipement de l’ESB devraient être nettoyées régulièrement.
Le volume minimal de produit qui doit être testé pour la stérilité est défini dans l’USP<71>3 et est basé sur le volume total du produit final. Malheureusement, l’USP<71> a été conçu à l’origine pour les produits pharmaceutiques stériles et est reconnu comme inapproprié pour les produits à courte durée de conservation en raison de la lenteur des délais d’exécution et du volume élevé des testsde produits 14. USP<1071> reconnaît que d’autres méthodes microbiennes rapides peuvent être bénéfiques et que des volumes d’essais de produits plus faibles peuvent être acceptables lorsqu’une approche fondée sur les risques a été appliquée14. Compte tenu des limites de l’USP<71> pour les tests de stérilité des produits de thérapie cellulaire, des méthodes alternatives telles que les méthodes respiratoires automatisées BacT/ALERT ont été utilisées dans l’industrie 1,4,6. Cependant, toute utilisation d’une méthode d’essai alternative nécessite une validation rigoureuse de l’utilisateur final pour démontrer la non-infériorité par rapport à la méthode officinale USP<71> pour ce produit 5,15,16. Des essais de pertinence de la méthode pour chaque nouveau produit sont également requis pour s’assurer que le produit, au volume d’inoculation et aux conditions d’essai choisis, n’est pas inhibiteur à la détection de faibles concentrationsde contaminants 6. Par conséquent, il est possible que le volume d’essai et le volume d’inoculation varient d’un produit à l’autre en fonction des résultats des études de validation. La filtration membranaire, une méthode secondaire décrite dans USP<71>, peut être utilisée pour échantillonner un plus grand volume d’échantillon en un seul essai. Les essais de validation et de pertinence de la méthode devraient inclure des organismes au-delà des six isolats officinaux de CQ. L’accent devrait être mis sur la flore fréquemment récupérée de l’installation et les contaminants des produits antérieurs. Une attention particulière doit être accordée aux champignons, car les méthodes de respiration seules ont démontré des performances sous-optimales 4,17, c’est pourquoi la méthode de test de stérilité alternative des NIH comprend une culture fongique appariée sur SAB et une inspection visuelle terminale des bouteilles BacT / ALERT.
Une limite majeure de tout programme de contrôle microbien est la nature rétrospective dans laquelle les résultats sont disponibles. Les tests de référence sont basés sur la culture, ce qui est lent et peut conduire à des mesures réactives constantes pour des mesures correctives. Les méthodes de test plus rapides nécessitent une validation rigoureuse, mais elles ne peuvent toujours pas fournir une assurance en temps réel de la surveillance et du contrôle microbiens. De plus, les cultures microbiologiques ne capturent qu’un petit sous-ensemble de temps au cours d’une session de production ou d’essai. Par conséquent, il est essentiel que la surveillance microbienne active ait lieu sur une base fréquente justifiée par le risque afin de s’assurer que les données sur les tendances sont bien établies. Cela permettra d’utiliser des limites d’alerte établies de manière appropriée pour prédire les écarts potentiels par rapport au contrôle microbien avant qu’ils ne se produisent.
L’établissement d’un solide programme cGTP/cGMP prend du temps et des efforts et, malheureusement, ne peut pas être simplement transféré d’un établissement à un autre. La Food and Drug Administration des États-Unis s’attend à ce que tous les programmes soient soumis à des tests de validation de l’utilisateur final malgré la disponibilité potentielle de résultats publiés par des tiers démontrant leur efficacité. Par conséquent, les stratégies de contrôle microbien et d’analyse peuvent différer d’un institut à l’autre en fonction de variables, notamment la conception de l’installation, la flore de l’installation et la classification des risques liés aux produits. Les stratégies décrites dans ce protocole aident à fournir un cadre permettant d’établir un programme robuste de surveillance et de contrôle microbiens pour les laboratoires cGTP/cGMP.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Institutes of Health Clinical Center. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les opinions officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20-25°C Incubator | Lab preference | ||
| 30-35°C Incubator | Lab preference | ||
| Alcohol-based hand sanitizer | Lab preference | ||
| BacT/ALERT Dual-T instrument | BioMerieux Industry | ||
| Beard cover | Lab preference | ||
| Biosafety cabinet (BSC) | Lab preference | ||
| Cleanroom shoes | Lab preference | ||
| Fluidthioglycollate medium (FTM) | Hardy Diagnostics | U84 | USP |
| Handheld cleaning mop | Contec | 2665LF | |
| Hypodermic needle | Lab preference | ||
| iFA+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412990 | |
| iFN+ BacT/ALERT bottle | Biomerieux | 412991 | |
| Isokinetic head | Lab preference | ||
| Laser particle counter | TSI Incorporated | 9500-01 | |
| LpH III | Steris | 1S16CX | |
| Mirror | Lab preference | ||
| Non-sterile bouffant | Lab preference | ||
| Non-sterile gloves | Lab preference | ||
| Non-sterile shoe covers | Lab preference | ||
| Non-sterile sleeve covers | Lab preference | ||
| Parafilm | Lab preference | ||
| Peridox RTU | Contec | CR85335IR | |
| Plastic bag | Lab preference | ||
| Sabouraud Dextrose Agar with Lecithinase and Tween (SABLT) | Hardy Diagnostics | P595 | USP, irradiated |
| Sabouraurd Dextrose Agar (SAB) | Hardy Diagnostics | W565 | USP, irradiated |
| Safety glasses | Lab preference | ||
| Scrubs (top and bottom) | Lab preference | ||
| Spor-Klenx RTU | Steris | 6525M2 | |
| Sterile 70% isopropyl alcohol (IPA) | Decon CiDehol | 8316 | |
| Sterile alcohol wipe | Lab preference | ||
| Sterile boot covers | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile coveralls | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile face mask | Lab preference | ||
| Sterile gloves | Lab preference | ||
| Sterile hood | Kimberly Clark | Cat# varies based on size | |
| Sterile low-lint wipes | Texwipe | TX3210 | |
| Sterile mop cleaning pads | Contec | MEQT0002SZ | |
| Sterile sleeve covers | Kimberly Clark | 36077 | |
| Sterile spreading rod | Fisher Scientific | 14665231 | |
| Sterile syringe | Lab preference | ||
| Tacky mats | Lab preference | ||
| Tryptic Soy Agar (TSA) | Hardy Diagnostics | W570R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Agar with Lecithinase and Tween (TSALT) | Hardy Diagnostics | P520R | USP, irradiated |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Hardy Diagnostics | U46 | USP |
| Tubing | Lab preference | ||
| Vesphene III | Steris | 1S15CX | |
| Viable air sampler | Hardy Diagnostics | BAS22K | |
| Vortex | Lab preference |
References
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