Justering av synlig lys optisk koherens tomografi fibergrammer med konfokale bilder av samme mus netthinnen

Summary

Den nåværende protokollen skisserer trinnene for justering in vivo synlig-lys optisk koherens tomografi fibergrafi (vis-OCTF) bilder med ex vivo konfokale bilder av samme mus retina med det formål å verifisere observert retinal ganglion celle aksonbunt morfologi i in vivo bilder.

Abstract

I de senere år har in vivo retinal imaging, som gir ikke-invasiv, sanntid og langsgående informasjon om biologiske systemer og prosesser, blitt brukt i økende grad for å oppnå en objektiv vurdering av nevrale skader i øyesykdommer. Ex vivo konfokal avbildning av samme netthinne er ofte nødvendig for å validere in vivo-funnene , spesielt i dyreforsøk. I denne studien demonstrerte vi en metode for å justere et ex vivo konfokalt bilde av musehinnen med sine in vivo-bilder . En ny klinisk klar bildebehandlingsteknologi kalt synlig lys optisk koherens tomografi fibergrafi (vis-OCTF) ble brukt til å skaffe in vivo bilder av musehinnen. Vi utførte deretter konfokal avbildning av samme netthinne som “gullstandarden” for å validere in vivo vis-OCTF-bildene. Denne studien muliggjør ikke bare videre undersøkelse av molekylære og cellulære mekanismer, men etablerer også et grunnlag for en sensitiv og objektiv evaluering av nevrale skader in vivo.

Introduction

Retinal ganglionceller (RGC) spiller en kritisk rolle i visuell informasjonsbehandling, mottar synaptiske innganger gjennom deres dendritiske trær i det indre plexiforme laget (IPL) og overfører informasjonen via deres axoner i retinal nervefiberlaget (RNFL) til hjernen 1,2,3,4. Ved syke tilstander som glaukom kan tidlig RGC-degenerasjon resultere i subtile endringer i RNFL, ganglioncellelaget (GCL), IPL og optisk nerve hos både pasienter og gnagermodeller 5,6,7,8,9. Tidlig påvisning av disse morfologiske endringene i RGC er derfor avgjørende for rettidig intervensjon for å forhindre RGC og synstap.

Vi har nylig utviklet en ny klinisk klar bildebehandlingsteknologi kalt synlig lys optisk koherenstomografi (vis-OCT) for å tilfredsstille behovet for in vivo-overvåking av RGC-skade. Vis-OCT forbedret den aksiale oppløsningen og nådde 1,3 μm i netthinnen^10,11, noe som muliggjorde visualisering av individuelle RGC-aksonbunter i RNFL. Deretter ble vis-OCT fibergrafi (vis-OCTF) etablert for å spore og kvantifisere RGC-skade på enkeltaksonbuntnivå i mus^11,12,13. Imidlertid er ex vivo konfokal avbildning av samme netthinne som gullstandarden ofte nødvendig for å validere in vivo-funnene. Derfor vil denne studien demonstrere hvordan man justerer in vivo-bilder tatt av vis-OCTF med ex vivo konfokale bilder av samme musenetthinne. Protokollen tar sikte på å validere in vivo-funnene ved ex vivo konfokal avbildning og etablere et grunnlag for å undersøke molekylære og cellulære endringer som ligger til grunn for RGC-skade ved syke tilstander.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Virginia og i samsvar med retningslinjene for bruk av dyr fra National Institute of Health (NIH). Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen. 1. In vivo vis-OCT-avbildning Vis-OCT-systemetSe for deg musens øyne ved hjelp av et lite dyr vis-OCT-system som br…

Representative Results

Det sammensatte vis-OCT-fibergrammet sammenlignes med det tilsvarende konfokale bildet av flatmontert retina immunfarget med Tuj-1 for RGC-aksoner (figur 1D, topppanel). Aksonbunter avbildet av vis-OCTF kan matches med Tu-j1-merkede aksonbunter på konfokalbildet. Blodkar viser vanligvis gjenkjennelige forgreningsstrukturer sammenlignet med omkringliggende aksonbunter i fibergrambilder, som kan matches med ICAM-2-merkede blodkar på konfokalbildet (figur 1D, ned…

Discussion

Det er to trinn i denne protokollen som krever oppmerksomhet. For det første er det nødvendig å sikre at dyret er under dyp anestesi og at øynene er fullt utvidet før vis-OCT avbildning. Hvis musene ikke er tilstrekkelig bedøvet, kan deres raske pust føre til ustabile bevegelser av ansiktsbildene, noe som kan påvirke kvaliteten på fibergrammet negativt. Videre kan utilstrekkelig utvidelse også ha en negativ innvirkning på bildekvaliteten, siden iris kan hindre lyset og hindre det i å nå netthinnen….

Materials

Equipment
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope	Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA)	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1-2 drops
Bovine serum albumin powder	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
Ketamine	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1	A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia		1:200
Normal donkey serum(NDS)	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
Rat anti-ICAM-2	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
Tropicamide drops	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 (Reagent Grade)	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg