可視光光干渉断層撮影ファイバーグラムと同一マウス網膜の共焦点像のアライメント
Summary
本プロトコルは、in vivo画像で観察された網膜神経節細胞軸索束形態を検証する目的で、同じマウス網膜のex vivo共焦点画像とin vivo可視光光干渉断層撮影ファイバーグラフィー(vis-OCTF)画像を位置合わせするための手順を概説する。
Abstract
近年、眼疾患の神経損傷を客観的に評価するために、生体内網膜イメージングは、生体システムやプロセスに関する非侵襲的、 リアルタイム、縦 断的情報を提供することがますます適用されています。同じ網膜の Ex vivo 共焦点イメージングは、特に動物研究において 、in vivo 所見を検証するためにしばしば必要になります。本研究では、マウス網膜の ex vivo共焦点像と in vivo 像をアライメントする方法を実証した。可視光光干渉断層撮影ファイバーグラフィー(vis-OCTF)と呼ばれる臨床対応の新しいイメージング技術を適用し、マウス網膜の in vivo 画像を取得しました。次に、「ゴールドスタンダード」と同じ網膜の共焦点イメージングを行い、 in vivo vs-OCTF画像を検証しました。本研究は、分子・細胞機構の解明を可能とするだけでなく、 生体内の神経損傷を高感度かつ客観的に評価するための基盤を確立するものです。
Introduction
網膜神経節細胞(RGC)は、内網状層(IPL)の樹状突起樹を介してシナプス入力を受け取り、網膜神経線維層(RNFL)の軸索を介して脳に情報を伝達する視覚情報処理において重要な役割を果たします1,2,3,4。緑内障などの病態では、早期のRGC変性により、患者とげっ歯類モデルの両方で、RNFL、神経節細胞層(GCL)、IPL、および視神経に微妙な変化が生じる可能性があります5,6,7,8,9。したがって、RGCのこれらの形態学的変化の早期検出は、RGCと視力喪失を予防するためのタイムリーな介入に不可欠です。
最近では、可視光干渉断層撮影法(vis-OCT)と呼ばれる臨床可能な新しいイメージング技術を開発し、RGC損傷の生体内モニタリングのニーズに応えています。Vis-OCTは軸方向分解能を改善し、網膜10,11で1.3μmに達し、RNFLの個々のRGC軸索束の可視化を可能にしました。その後、マウスの単軸索束レベルでのRGC損傷を追跡および定量化するために、vis-OCTファイバーグラフィー(vis-OCTF)が確立されました11,12,13。ただし、ゴールドスタンダードと同じ網膜のex vivo共焦点イメージングは、in vivo所見を検証するために必要になることがよくあります。したがって、この研究では、vis-OCTFによって取得されたin vivo画像を、同じマウス網膜のex vivo共焦点画像と位置合わせする方法を示します。プロトコルはex vivoの共焦点イメージ投射によって生体内の調査結果を検証し、病気の状態のRGCの損傷の根底にある分子および細胞変化を検査するための基盤を確立することを向ける。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルには、注意が必要な 2 つのステップがあります。まず、OCT画像診断の前に、動物が深い麻酔下にあり、目が完全に拡張していることを確認する必要があります。マウスに十分な麻酔がかけられていないと、呼吸が速くなり、 顔 画像の動きが不安定になり、ファイバーグラムの品質に悪影響を及ぼす可能性があります。さらに、拡張が不十分な場合、虹彩が光を遮り、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、緑内障研究財団シェイファー助成金、4-CA Cavalier Collaborative Award、R01EY029121、R01EY035088、およびテンプル騎士団眼科財団によってサポートされています。
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
References
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
- Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
- Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
- Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
- Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
- Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
- Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
- Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
- Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
- Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
- Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
- Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
- Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
- Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
- Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
- Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
