Summary
Apresentamos aqui um protocolo eficaz de perfusão rápida de sangue para preparar amostras de tecido de rãs africanas com garras para estudos transcriptômicos e proteômicos.
Abstract
Xenopus têm sido poderosos organismos modelo para entender o desenvolvimento de vertebrados e doenças por mais de 100 anos. Aqui, um protocolo de perfusão sanguínea rápida em Xenopus, visando uma redução consistente e drástica do sangue dentro de todos os tecidos, é definido. A perfusão é realizada inserindo uma agulha diretamente no ventrículo do coração e bombeando solução salina tamponada com fosfato heparinizado (PBS) através do sistema vascular. O procedimento pode ser concluído em aproximadamente 10 min por animal. O sangue é dominado por algumas proteínas e tipos celulares altamente abundantes, criando inúmeros problemas, pois essas proteínas mascaram a maioria das outras moléculas e tipos celulares de interesse. A caracterização reprodutível de tecidos adultos de Xenopus com proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única se beneficiará da aplicação deste protocolo antes da amostragem de órgãos. Os protocolos para amostragem de tecidos são definidos em artigos complementares. Esses procedimentos visam à padronização de práticas entre Xenopus de diferentes sexos, idades e estados de saúde, especificamente X. laevis e X. tropicalis.
Introduction
A perfusão de corpo inteiro dos anfíbios é rotineiramente completada para fins de preservação e fixação 1,2,3,4,5,6. No entanto, esses procedimentos ocorrem a uma taxa que limita o número de amostras frescas que podem ser coletadas por animal. O objetivo deste trabalho é desenvolver um protocolo de perfusão sanguínea efetivo em Xenopus, priorizando a velocidade da técnica. O protocolo leva menos de 10 min por animal para X. tropicalis e menos de 15 min por animal X. laevis. As prioridades secundárias são a facilidade de replicação e o uso de equipamentos de fácil aquisição para que amostras de alta qualidade possam ser amplamente compartilhadas entre os laboratórios Xenopus.
As rãs Xenopus são amplamente utilizadas em pesquisas biomédicas para estudar processos biológicos e patológicos fundamentais conservados entre espécies. Este tetrápode tem uma relação evolutiva mais próxima com os mamíferos do que outros modelos aquáticos, tendo pulmões, um coração de três câmaras e membros com dedos. A comunidade internacional usa efetivamente o Xenopus para obter uma compreensão mais profunda da doença humana por meio de modelagem profunda da doença e análise molecular da função gênica relacionada à doença. As inúmeras vantagens do Xenopus como modelo animal os tornam ferramentas inestimáveis para estudar as bases moleculares do desenvolvimento humano e das doenças; Essas vantagens incluem: grande tamanho do ovócito e do embrião, alta fecundidade, facilidade de alojamento, rápido desenvolvimento externo e facilidade de manipulação genômica. Estima-se que o Xenopus compartilhe ~80% dos genes de doenças humanas identificados7.
Em comparação com modelos populares de mamíferos, o Xenopus é um modelo rápido e econômico, com a facilidade de knock-down de morfolinos e disponibilidade de transgênicos eficientes e mutações gênicas direcionadas usando CRISPR8. A espectrometria quantitativa de massas e a transcriptômica unicelular têm sido aplicadas com sucesso em embriões de Xenopus9,10, mas um atlas celular recente de Xenopus laevis mostra que a composição da maioria dos tecidos é dominada pelos tipos de células sanguíneas 11. Ao desenvolver uma técnica que exsanguina o tecido em um ritmo rápido e usando meios refrigerados, o frescor da amostra é minimamente afetado pela perfusão. Isso é particularmente importante para aplicações onde o objetivo é traçar o perfil fisiologicamente não perturbado do RNAm ou da expressão de proteínas.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e regulamentos da Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
NOTA: Embora o método primário de eutanásia descrito seja considerado uma técnica aceitável para eutanásia pela Associação Médica VeterináriaAmericana 12, não foi encontrado que levasse à cessação de um batimento cardíaco13. Mesmo o método secundário frequentemente usado de pithing duplo não impede isso, nem remove o coração do animal. A exsanguinação de animais anestesiados é considerada um método humano e eficaz para o sucesso da eutanásia12. Como a manutenção de tecidos frescos através da eutanásia é o objetivo deste protocolo, é benéfico que o coração continue a bater através da eutanásia primária com MS-222, e que a perfusão seja em si um método de eutanásia secundária através da exsanguinação.
1. Preparo
- Certificar-se de que a instituição de pesquisa aprovou a técnica de eutanásia e perfusão descrita neste protocolo.
- Preparar uma solução de 5 g/L MS-222 (metanossulfonato de tricaina) e 5 g/L de bicarbonato de sódio. O volume deve ser maior do que o volume necessário para cobrir completamente os animais a serem eutanasiados. Verifique o pH para garantir que está ≥7.
- Preparar 500 μL de 180 U/mL de heparina em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por X. laevis, ou 200 μL por X. tropicalis.
- Realizar a eutanásia primária colocando o Xenopus nesta solução (a partir do passo 1.2); O animal permanecerá submerso por um total de 1 h.
- Confirme que o Xenopus perdeu sua resposta de dor ao beliscar o pé 15 minutos após a eutanásia. Se o animal for reativo, devolva-o à solução de eutanásia até que essa resposta seja perdida.
- Pese o Xenopus e faça todas as medições adicionais necessárias antes da amostragem.
- Com uma agulha de 31 G, injetar X. laevis com 250 μL e X. tropicalis com 100 μL de 180 U/mL de heparina em PBS (a partir do passo 1.3) na musculatura de cada membro torácico.
- Preparar uma solução de 1 mL/g do peso do animal de 54 U/mL de heparina em perfusato de PBS. Indivíduos mais experientes com esse protocolo podem achar que menos meios são necessários para completar a perfusão.
- Use uma agulha hipodérmica 22 G para perfundir X. laevis e uma agulha hipodérmica 25 G para X. tropicali s. Embotar a agulha de perfusão aparando a ponta com cortadores de arame (Figura 1)14.
NOTA: Isso reduz a probabilidade de a agulha perfurar através do ventrículo se deslocada. Além de embotar, a agulha pode ser ligeiramente moída com uma pedra afiada ou lima, mas ainda permanecendo afiada o suficiente para perfurar o ventrículo. - Preparar a bomba ligando a agulha aparada e circulando 54 U/mL de perfusato de PBS heparinizado (a partir do passo 1.8). Certifique-se de purgar todas as bolhas de ar da tubulação para eliminar a possibilidade de embolia gasosa, o que leva à diminuição da eficiência ou falha da perfusão (ver Tabela 1). Manter o meio de perfusão no gelo durante todo o procedimento.
- Se a bomba não for programável, com a agulha no lugar, meça o volume bombeado do meio sob as diferentes configurações para determinar quais configurações estão mais próximas de 5 mL/min e 10 mL/min. Estes caudais serão utilizados independentemente da espécie. Se a bomba de perfusão for programável, calibre-a com a agulha no lugar, seguindo as instruções do fabricante.
- Coloque a superfície de dissecção (bandeja ou folha de espuma) em uma inclinação dentro de um recipiente secundário ou arranje-a para facilitar a drenagem do sangue.
- Uma vez que a rã tenha estado na solução por 1 h, a eutanásia primária foi concluída. Remova a rã e verifique novamente a perda de resposta à dor realizando uma pinça no pé.
- Coloque a rã de costas e fixe cada membro (Figura 2). Se for necessário preservar o tecido dos membros, pinos finos podem ser colocados através dos dedos ou grampos em forma de U ao redor dos membros.
- Com tesoura de dissecção, corte a pele, suba a linha média e depois lateralmente, confeccionando dois retalhos. (Gráfico 2)
- Use pinça para agarrar a linha alba e puxá-la para longe da cavidade celômica (Figura 3). Use cuidadosamente a tesoura para cortar a musculatura. Faça dois retalhos para fora da parede da cavidade e corte ou fixe todos os retalhos fora do caminho.
- Utilizar tesoura de dissecção para cortar os ossos coracoide e cortar o excesso de tecido para melhor acesso ao coração (Figura 3).
- O coração ainda deve estar batendo. Se o coração parou de bater antes da perfusão, observe que o frescor da amostra foi comprometido.
2. Perfusão
- Identifique o estômago e desloque-o suavemente para que fique em cima do lobo esquerdo do fígado (à direita do observador), com sua vasculatura visível durante o procedimento. Identifique um pulmão e segure-o por sua ponta usando pinças de tecido. Puxar o pulmão para fora da cavidade celômica e fixá-lo através da ponta (Figura 4). Faça isso suavemente, pois os vasos sanguíneos quebrados não perfundem bem. Observe se o sangue é visível dentro do lóbulo, pois isso afetará a capacidade de determinar a conclusão do procedimento.
- Tire uma imagem da cavidade celômica para avaliar melhor a eficiência da perfusão e potencialmente identificar tecidos anormais em uma data posterior.
- Identificar o pericárdio fino e tracioná-lo com pinça de tecido (Figura 5). Perfurar suavemente o pericárdio usando a ponta da tesoura de iridectomia, tomando cuidado para não cortar os tecidos subjacentes. Descasque o pericárdio para longe das três câmaras do coração.
- Use pinças para segurar suavemente o ventrículo pelo seu ápice. Aplicar pressão limitada para que haja espaço suficiente entre as superfícies de tração da pinça para a passagem da agulha de perfusão (Figura 6).
- Inserir a agulha através do fechamento da pinça na câmara do ventrículo, tomando cuidado para não perfurar através do ventrículo (Figura 7). Aperte a pinça de tecido no lugar usando um suporte de agulha usando um hemostático.
NOTA: Esta técnica estabiliza a posição da agulha, que ainda está afiada. O pinçamento da agulha diretamente no ventrículo também causará danos desnecessários, dificultando a recuperação caso seja necessário (ver Tabela 1). - Iniciar o fluxo da bomba em aproximadamente 5 mL/min. As três câmaras do coração e do tronco arterial irão ingurgitar (Figura 8; ver Tabela 1).
- Com tesoura, lance cuidadosamente a aurícula direita (à esquerda do espectador); sangue derramará. Ajuste o fluxo em 5 mL/min ou aumente-o para 10 mL/min.
- Continue até que a vasculatura do estômago se abra (ver Tabela 1), depois lance a aurícula esquerda do coração (à direita do espectador). Se o fluxo ainda for de 5 mL/min, aumente-o para aproximadamente 10 mL/min.
- Use uma pipeta de transferência para enxaguar a cavidade celômica em meios de perfusão, para ajudar a manter a visibilidade e avaliar melhor a cor do perfusato que flui das aurículas.
- Manter a agulha no lugar até que o perfusato que flui das aurículas esteja claro (ver Tabela 1) e o pulmão tenha perdido sua tonalidade vermelha (ver Tabela 1; Gráfico 9).
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Representative Results
Após uma perfusão bem-sucedida, todos os tecidos (excluindo o fígado em Xenopus pigmentado) serão nitidamente mais leves e menos saturados de sangue. Os principais vasos sanguíneos tornar-se-ão menos perceptíveis (Figura 10), e os tecidos (excluindo o fígado) serão enxaguados de forma limpa no tampão após a amostragem. Embora a execução bem-sucedida do protocolo só possa ser confirmada pela qualidade dos dados das amostras de tecido exsangüinado, vários problemas típicos, suas possíveis causas e ações corretivas sugeridas são fornecidos na tabela de solução de problemas (Tabela 1 e Figura 11).
Figura 1: Agulhas não aparadas e aparadas14. Usando cortadores de arame, embote a agulha cortando sua ponta. Ele será afiado o suficiente para perfurar o coração, mas perfurar o ventrículo será menos provável no caso de erro humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fêmea madura de X. tropicalis fixada em cada membro. Use pinças dissecantes dentadas para puxar a pele perto da cloaca ensinada a perfurá-la com tesoura de dissecção e criar dois retalhos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Parede muscular. Com a pele ventral aberta, mas a parede muscular intacta, a linha alba é visível. Para reduzir a probabilidade de danificar os tecidos subjacentes, agarre a linha alba e puxe-a antes de cortar. Os ossos coracóides são visíveis através do peritônio. Uma vez que a cavidade celômica foi aberta, esses ossos devem ser reduzidos para dar melhor acesso ao coração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cavidade celômica de um macho maduro de X. tropicalis. Os ossos coracoides foram reduzidos, proporcionando acesso ao coração fechado com pericárdio. O estômago foi deslocado na frente do lobo esquerdo do fígado, e sua vasculatura é claramente visível. O pulmão esquerdo foi retirado da cavidade celômica por sua ponta e fixado para garantir que não se retraia durante o processo de enxágue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Pericárdio. O pericárdio é uma membrana fina e resistente que envolve o coração. Usando pinças de tecido, segure suavemente o pericárdio e, em seguida, use a ponta da tesoura de iridectomia para perfurá-lo. Uma vez perfurado, descasque-o, longe do coração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Diagramas de colocação da agulha de anatomia cardíaca . (A) Diagrama ventral de um coração de X. laevis. (B) Diagrama cardíaco, com o pericárdio retirado, mostrando o correto posicionamento da agulha e da pinça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Anatomia cardíaca e fotografia do posicionamento da agulha. Com o pericárdio removido, as três câmaras do coração e do tronco arterial são facilmente visíveis. Use pinça para segurar suavemente o ventrículo pelo ápice e, em seguida, insira a agulha através da pinça. Cuidado para não causar danos desnecessários ao ventrículo ou outras câmaras, pois isso comprometerá a eficiência da perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: A perfusão está em andamento. A aurícula direita foi lanceda, e o ventrículo, o tronco arterial e a aurícula esquerda estão visivelmente ingurgitados. O estômago está branqueando e tanto o meio que sai do animal quanto o tecido pulmonar estão fortemente saturados de sangue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Cavidade celômica após rápida perfusão e enxágue com sucesso. A vasculatura do estômago e de outros órgãos já não é facilmente visível. A menos que o Xenopus seja albino, o fígado permanecerá fortemente pigmentado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Amostras de tecidos de um macho albino X. laevis não perfundido e perfundido. As diferenças na pigmentação e visibilidade da vasculatura são pronunciadas. Todas as amostras estão dentro de poços de 3,5 cm de diâmetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Diagramas de solução de problemas de um coração Xenopus . (A) O ventrículo tem perfuração (em vermelho); Essa perfuração é isolada pela pinça e não afetará a eficiência da perfusão. (B) Um coração com um ventrículo gravemente danificado. A agulha pode ser guiada para dentro do tronco arterial e pinçada no lugar. É especialmente importante garantir que a agulha esteja bem embotada ao usar essa técnica14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Avaliação da eficiência da perfusão em albinos. Um albino X. laevis antes (A) e depois (B) de perfusão rápida. O albinismo torna mais fácil determinar a proficiência da perfusão do que seria em um animal pigmentado. Isto é especialmente aparente nos tecidos pulmonares e hepáticos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Tabela de solução de problemas. Vários problemas típicos, suas possíveis causas e ações corretivas sugeridas são fornecidos. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Este protocolo descreve as técnicas tradicionais de dissecção para acesso à cavidade celômica. Outras técnicas também são aceitáveis, desde que causem danos mínimos aos tecidos, o coração seja acessível e o pulmão e o estômago sejam visíveis. Da mesma forma, a maioria das ferramentas de dissecção listadas pode ser facilmente substituída por itens comparáveis.
Embora tenham sido feitas tentativas para otimizar a eficácia desse procedimento, os resultados podem variar dependendo da experiência e da variabilidade entre rãs individuais. Um aspecto interessante da perfusão sanguínea que ficou fora do escopo deste trabalho é como esse procedimento se compara a formas alternativas de perfusão para animais submetidos à cirurgia. Outra variável inexplorada é como a perfusão sanguínea funcionaria em animais muito jovens ou de idade avançada, onde a vasculatura pode ser excessivamente frágil. São fornecidas observações adicionais para facilitar a aplicação deste protocolo. Vários problemas típicos, suas possíveis causas e ações corretivas sugeridas são apresentados na Tabela 1.
Uma limitação desse procedimento é que a eficiência da perfusão pode ser negativamente impactada pela sua velocidade. Se a eficiência da perfusão tem precedência sobre a perfusão rápida, recomenda-se a adaptação da técnica de axolote1 (Saltman et al. usam o termo aorta para se referir ao tronco arterial).
A duração do procedimento e o volume de mídia utilizada dependem de uma série de variáveis. Geralmente, os machos de X. tropicalis levam entre 2-3 min para perfundir com sucesso com 15-25 mL de meio, enquanto as fêmeas de X. tropicalis levam entre 3-4 min com 25-40 mL de meio . Significativamente mais variação animal-animal foi encontrada ao perfundir X. laevis. Embora uma taxa de fluxo mais alta diminua o tempo necessário para perfundir animais maiores, o aumento da pressão da linha pode facilmente levar ao deslocamento dos encaixes do tubo e à falha da bomba.
Naturalmente, é muito mais fácil avaliar a eficiência da perfusão em animais albinos. A diferença é especialmente aparente nos tecidos pulmonar e hepático (Figura 12). Assim, recomenda-se o uso de albinos, principalmente na primeira tentativa de perfusão ou em treinamento.
Ao ajustar a taxa de fluxo e o tamanho da agulha, o protocolo é adaptável para todas as espécies de Xenopus. Devido à homologia na anatomia cardíaca e na circulação sanguínea entre Xenopus e a maioria dos outros anfíbios15, bem como répteis não crocodilianos, essa técnica pode ser modificada para perfusão rápida de corpo inteiro de outros modelos com corações tricamerados16. Se for utilizado um modelo de réptil não crocodiliano que exija exclusivamente a perfusão de um dos arcos aórticos, outros protocolos são recomendados17.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo OD031956 de concessão OD R24 do NIH e pelo HD073104 de concessão NICHD R01. Agradecemos a Darcy Kelly pelas discussões úteis e contribuições iniciais sobre este protocolo. Também gostaríamos de agradecer a Samantha Jalbert, Jill Ralston e Wil Ratzan por sua assistência e apoio, bem como aos nossos três revisores anônimos por seus comentários.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x Magnifying glass with LED light and stand | amazon.com | B08QJ6J8P1 | light must not produce heat |
| Disposable transfer pipets | VWR | 414004-036 | |
| Dissecting fine-pointed forceps | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissection tray | Fisher Scinetific | 14-370-284 | styrofoam sheets are an acceptable alternative |
| Euthanasia container | US Plastic | Item 2860 | alternative opaque containers acceptable |
| Euthanasia container lid | US Plastic | Item 3047 | |
| Fine dissection pins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| General use hypodermic needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | for X. laevis |
| General use hypodermic needles, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | for X. tropicalis |
| Heparin, porcine intestinal mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectomy scissors 6" | vwr | 470018-938 | iris scissors are an acceptable alternative |
| Luer-to-barb adapter male Luer with lock ring | amazon.com | B09PTX6M2Z | size will be dependant on the hosing of the pump used |
| Mayo-Hegar needle holder | Fisher Scinetific | 08-966 | mosquito forceps are an acceptable alternative |
| MS-222: Syncaine (formerly tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltic liquid pump dosing pump 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | any peristaltic pump capable of pumping 5-10mL/min is acceptable |
| Sharpening stone | VWR | 470150-112 | optional; for dulling needles |
| Sodium bicarbonate, powder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimen forceps, serrated | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins for dissecting | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fine short insulin syringes, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Wire flush cutters, 6-inch ultra sharp & powerful side cutter clippers | amazon.com | B087P191LP |
References
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