Een verbeterde techniek voor trimethylaminedetectie in diergeneesmiddelen door Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Summary
Hier wordt een headspace gaschromatografie-tandem quadrupool massaspectrometrie (HS-GC-MS/MS) methode beschreven die geschikt is voor de bepaling van trimethylamine (TMA) in diergeneesmiddelen. Het protocol omvat monstervoorbehandeling, headspace-behandeling, analyseomstandigheden, methodologische validatie en de bepaling van TMA in geneesmiddelen van dierlijke oorsprong.
Abstract
Diergeneesmiddelen hebben onderscheidende kenmerken en significante genezende effecten, maar de meeste hebben een duidelijke visgeur, wat resulteert in de slechte naleving van klinische patiënten. Trimethylamine (TMA) is een van de belangrijkste visgeurcomponenten in de diergeneeskunde. Het is moeilijk om TMA nauwkeurig te identificeren met behulp van de bestaande detectiemethode vanwege de verhoogde druk in de headspace-injectieflacon veroorzaakt door de snelle zuur-basereactie na de toevoeging van loog, waardoor TMA uit de headspace-injectieflacon ontsnapt, waardoor de onderzoeksvoortgang van de visgeur van dierlijke medicijnen wordt vertraagd. In deze studie stelden we een gecontroleerde detectiemethode voor die een paraffinelaag introduceerde als isolatielaag tussen zuur en loog. De snelheid van TMA-productie kan effectief worden gecontroleerd door de paraffinelaag langzaam vloeibaar te maken door middel van thermostatische ovenverwarming. Deze methode toonde bevredigende lineariteit, precisie-experimenten en terugvorderingen met een goede reproduceerbaarheid en hoge gevoeligheid. Het bood technische ondersteuning voor de deodorisatie van dierlijke medicijnen.
Introduction
De behandeling van ziekten bij de mens door gebruik te maken van producten die zijn afgeleid van dierlijke delen en/of hun bijproducten (hier aangeduid als geneesmiddelen van dierlijke oorsprong) krijgt steeds meer aandacht. Ze spelen een belangrijke rol bij de behandeling van kanker, hart- en vaatziekten, levercirrose, mastitis en andere ziekten, met de voordelen van een sterk effect, kleine dosering en significante en specifieke klinische werkzaamheid. Dierlijke geneesmiddelen hebben echter over het algemeen een prominente visgeur, die de therapietrouw van patiënten sterk beïnvloedt en vooral ongunstig zijn voor kinderen 1,2. De visgeur komt voornamelijk van de eiwitten, aminozuren, vetten en andere stoffen in het geneesmiddel, die worden afgebroken door vetzuuroxidatie, aminozuurafbraak en andere manieren om een verscheidenheid aan stoffen te produceren met een visachtige geur 2,3,4. Onder hen is trimethylamine (TMA) een vluchtig gas met een visachtige geur die veel voorkomt in rottende of rotte dierlijke voedingsmiddelen5.
Tot nu toe werden gaschromatografie (GC), vloeistofchromatografie (LC), ionchromatografie, spectrofotometrie, vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) en sensormethoden vaak gebruikt om TMA in het milieu, voedsel en urine te detecteren 6,7,8,9. Gezien de lage verontreiniging van de GC-kolom en het injectiesysteem, evenals de hoge gevoeligheid, reproduceerbaarheid en lage detectiegrens (0,1-1 mg/kg), werd de voorkeur gegeven aan de headspace gaschromatografie-massaspectrometrie (HS-GC-MS) methode voor voedsel- en biologische analyse8. Op dit moment heeft alleen China een nationale standaard voor TMA in voedsel vastgesteld en HS-GC-MS is de eerste methode in de GB5009.179-2016-standaard10. Daarom werd de bovenstaande HS-GC-MS-methode gekozen om TMA te detecteren in diergeneesmiddelen. In het vroege stadium ontdekte onze onderzoeksgroep dat de HS-GC-MS-detectiestandaard voor TMA in voedsel de visgeur in verschillende van dieren afkomstige geneesmiddelen kon detecteren. In combinatie met de resultaten van de studies11,12 kon worden bewezen dat TMA de gemeenschappelijke sleutelstof is van visgeur in diergeneesmiddelen. Er werd echter vastgesteld dat de reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten slecht was en dat er problemen waren zoals TMA-ontsnapping en slechte stabiliteit, die niet door de methodologie konden worden geverifieerd. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat het loog in de headspace-injectieflacon werd geïnjecteerd en de snelle zuur-basereactie leidde tot verhoogde druk in de injectieflacon, waardoor TMA uit de injectieporie ontsnapte, waardoor de stabiele en nauwkeurige detectie van TMA werd voorkomen. Daarom stelde deze studie een verbeterde headspace gaschromatografie-tandem quadrupool massaspectrometrie (HS-GC-MS/MS) detectiemethode voor om deze problemen aan te pakken.
Het protocol verbetert de monstervoorbehandeling door de zuur-base reactanten in de voorbehandeling te scheiden met behulp van vaste paraffine, een goed vast-vloeibaar faseveranderingsmateriaal. Terwijl de paraffine langzaam vloeibaar werd met de temperatuurstijging van de thermostatische oven, werd TMA ook langzaam vrijgegeven in de afgesloten headspace-injectieflacon, waardoor de drukverhoging veroorzaakt door de gewelddadige en snelle zuur-basereactie werd vermeden en een stabiele en nauwkeurige TMA-detectie werd gegarandeerd. Verder onderdrukte de headspace-injectie in combinatie met meervoudige reactiemonitoring (MRM) in GC-MS / MS effectief matrix chemische interferentie en zorgde voor de betrouwbaarheid van de resultaten. De resultaten van de methodologische validatie bewezen dat de lineariteit, precisietest en herstelsnelheid van de verbeterde detectiemethode aan de vereisten konden voldoen, met een goede reproduceerbaarheid en hoge gevoeligheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dierlijke geneesmiddelen komen uit het hele lichaam, organen of weefsels, fysiologische of pathologische producten, uitscheidingen of afscheidingen en verwerkte producten van dieren. TMA is een belangrijke bron van visgeur in geneesmiddelen van dierlijke oorsprong; het is een typische stinkende stof met een zeer lage reukdrempel (0,000032 × 10-6 V/V) en een sterke visgeur13. Op dit moment kan de veelgebruikte HS-GC-MS-methode TMA in diergeneesmiddelen niet stabiel en nauwkeurig detecte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82173991) en het Sichuan Science and Technology Program (2022YFS0442).
Materials
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
References
- Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
- Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
- Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
- Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).
- Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
- Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318 (2022).
- Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
- Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).
- Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
- National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China. . GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).
- Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
- Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
- Yoshiharu, I. . Odor olfactory measurement. , (2004).
- Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).
