Eine verbesserte Technik zum Nachweis von Trimethylamin in der Tierarzneimittel mittels Headspace-Gaschromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie
Summary
Hier wird eine Headspace-Gaschromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie-Methode (HS-GC-MS/MS) beschrieben, die für die Bestimmung von Trimethylamin (TMA) in tierischen Arzneimitteln geeignet ist. Das Protokoll umfasst die Vorbehandlung der Proben, die Headspace-Behandlung, die Analysebedingungen, die methodische Validierung und die Bestimmung der TMA in Arzneimitteln tierischen Ursprungs.
Abstract
Arzneimittel tierischen Ursprungs haben charakteristische Eigenschaften und signifikante heilende Wirkungen, aber die meisten von ihnen haben einen offensichtlichen Fischgeruch, was zu einer schlechten Compliance der klinischen Patienten führt. Trimethylamin (TMA) ist eine der wichtigsten Bestandteile des fischigen Geruchs in der tierischen Medizin. Es ist schwierig, TMA mit der bestehenden Nachweismethode genau zu identifizieren, da der erhöhte Druck im Headspace-Fläschchen durch die schnelle Säure-Base-Reaktion nach der Zugabe von Lauge verursacht wird, was dazu führt, dass TMA aus dem Headspace-Fläschchen entweicht und den Forschungsfortschritt des fischigen Geruchs von tierischen Arzneimitteln zum Stillstand bringt. In dieser Studie schlugen wir eine kontrollierte Nachweismethode vor, bei der eine Paraffinschicht als Isolationsschicht zwischen Säure und Lauge eingeführt wurde. Die Geschwindigkeit der TMA-Produktion konnte durch langsame Verflüssigung der Paraffinschicht durch thermostatische Ofenheizung effektiv gesteuert werden. Diese Methode zeigte zufriedenstellende Linearität, Präzisionsexperimente und Wiederfindungen mit guter Reproduzierbarkeit und hoher Empfindlichkeit. Sie leistete technische Unterstützung bei der Desodorierung von Arzneimitteln tierischen Ursprungs.
Introduction
Die Behandlung menschlicher Krankheiten durch die Verwendung von Produkten, die aus tierischen Teilen und/oder deren Nebenprodukten gewonnen werden (hier als Arzneimittel tierischen Ursprungs bezeichnet), erhält zunehmend Aufmerksamkeit. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Behandlung von Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Leberzirrhose, Mastitis und anderen Krankheiten, mit den Vorteilen einer starken Wirkung, einer geringen Dosierung und einer signifikanten und spezifischen klinischen Wirksamkeit. Tierische Arzneimittel haben jedoch im Allgemeinen einen ausgeprägten Fischgeruch, der die Compliance der Patienten stark beeinträchtigt und besonders für Kinder ungünstig ist 1,2. Der fischige Geruch kommt hauptsächlich von den Proteinen, Aminosäuren, Fetten und anderen Substanzen, die im Arzneimittel enthalten sind, die durch Fettsäureoxidation, Aminosäureabbau und andere Wege zersetzt werden, um eine Vielzahl von Substanzen mit einem fischigen Geruch zu produzieren 2,3,4. Unter ihnen ist Trimethylamin (TMA) ein flüchtiges Gas mit einem fischigen Geruch, das in verrottenden oder verdorbenen tierischen Lebensmitteln weit verbreitet ist5.
Bisher wurden Gaschromatographie (GC), Flüssigkeitschromatographie (LC), Ionenchromatographie, Spektrophotometrie, Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Sensormethoden verwendet, um TMA in der Umwelt, in Lebensmitteln und im Urin nachzuweisen 6,7,8,9. Angesichts der geringen Kontamination der GC-Säule und des Injektionssystems sowie der hohen Sensitivität, Reproduzierbarkeit und niedrigen Nachweisgrenze (0,1-1 mg/kg) wurde die Headspace-Gaschromatographie-Massenspektrometrie (HS-GC-MS) für die Lebensmittel- und biologische Analytik bevorzugt8. Derzeit hat nur China einen nationalen Standard für TMA in Lebensmitteln festgelegt, und HS-GC-MS ist die erste Methode in der Norm GB5009.179-201610. Daher wurde die oben beschriebene HS-GC-MS-Methode ausgewählt, um TMA in tierischen Arzneimitteln nachzuweisen. In einem frühen Stadium fand unsere Forschungsgruppe heraus, dass der HS-GC-MS-Nachweisstandard für TMA in Lebensmitteln den Fischgeruch in mehreren tierischen Arzneimitteln nachweisen kann. In Kombination mit den Ergebnissen der Studien11,12 konnte nachgewiesen werden, dass TMA die häufigste Schlüsselsubstanz des Fischgeruchs in tierischen Arzneimitteln ist. Es zeigte sich jedoch, dass die Reproduzierbarkeit der experimentellen Ergebnisse schlecht war und es Probleme wie TMA-Entweichen und schlechte Stabilität gab, die durch die Methodik nicht verifiziert werden konnten. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Lauge in das Headspace-Fläschchen injiziert wurde und die schnelle Säure-Base-Reaktion zu einem erhöhten Druck im Fläschchen führte, wodurch TMA aus der Injektionspore entwich, was den stabilen und genauen Nachweis von TMA verhinderte. Daher wurde in dieser Studie eine verbesserte Detektionsmethode der Headspace-Gaschromatographie-Tandem-Quadrupol-Massenspektrometrie (HS-GC-MS/MS) vorgeschlagen, um diese Probleme anzugehen.
Das Protokoll verbessert die Probenvorbehandlung, indem die Säure-Base-Reaktanten in der Vorbehandlung mit Hilfe von festem Paraffin, einem guten Fest-Flüssig-Phasenwechselmaterial, getrennt werden. Als sich das Paraffin mit dem Temperaturanstieg des thermostatischen Ofens langsam verflüssigte, wurde TMA auch langsam in der versiegelten Headspace-Durchstechflasche freigesetzt, wodurch der durch die heftige und schnelle Säure-Base-Reaktion verursachte Druckanstieg vermieden und ein stabiler und genauer TMA-Nachweis gewährleistet wurde. Darüber hinaus unterdrückte die Headspace-Injektion in Kombination mit MRM-Modi (Multiple Reaction Monitoring) in GC-MS/MS effektiv chemische Interferenzen in der Matrix und stellte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicher. Die Ergebnisse der methodischen Validierung zeigten, dass die Linearität, der Präzisionstest und die Wiederfindungsrate der verbesserten Detektionsmethode die Anforderungen mit guter Reproduzierbarkeit und hoher Empfindlichkeit erfüllen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arzneimittel tierischen Ursprungs stammen aus dem ganzen Körper, aus Organen oder Geweben, aus physiologischen oder pathologischen Produkten, aus Ausscheidungen oder Sekreten und aus verarbeiteten Produkten von Tieren. TMA ist eine wichtige Quelle für fischigen Geruch in Arzneimitteln tierischen Ursprungs. Es handelt sich um eine typische übelriechende Substanz mit einer sehr niedrigen Riechschwelle (0,000032 × 10-6 V/V) und einem starken Fischgeruch13. Derzeit kann die gängige HS-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82173991) und des Sichuan Science and Technology Program (2022YFS0442) unterstützt.
Materials
| Centrifuge | Beckman Coulter Trading (China) Co. | SSC-2-0213 | |
| Chinese herbal medicine grinder | Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory | HX-200K | |
| Convection oven | Sanyo Electric Co., Ltd | MOV-112F | |
| Decapper for 20 mm Aluminum caps | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | V1750004 | |
| Electronic balance | Shimadzu Corporation Japan | AUW220D | |
| Gas chromatography mass spectrometry | Shimadzu Corporation Japan | TQ-8050 NX | |
| Headspace Vial | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | 25760200 | |
| Homogenizer | Shanghai biaomo Factory | FJ200-SH | |
| Preassembled Cap | ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc | L4150050 | |
| Sample sieve | Zhenxing Sieve Factory | / | |
| SH-Volatile Amine | Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd | 227-3626-01 | |
| Sodium hydroxide | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022101401 | |
| Solid paraffin wax | Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory | 20221112 | |
| Trichloroacetic acid | Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd | 2022102001 | |
| Trimethylamine hydrochloride | Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd | AF22022108 | |
| Ultra-pure water system | Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd | UPR-11-5T |
References
- Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
- Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
- Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
- Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).
- Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
- Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318 (2022).
- Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
- Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).
- Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
- National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China. . GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).
- Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
- Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
- Yoshiharu, I. . Odor olfactory measurement. , (2004).
- Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).
