Protocolo de ensaio de cisalhamento para a determinação de propriedades de material de célula única
Summary
Este protocolo descreve a quantificação das propriedades mecânicas de linhagens celulares cancerosas e não cancerosas in vitro. Diferenças conservadas na mecânica de células cancerosas e normais podem atuar como um biomarcador que pode ter implicações no prognóstico e diagnóstico.
Abstract
A biomecânica irregular é uma marca da biologia do câncer sujeita a extenso estudo. As propriedades mecânicas de uma célula são semelhantes às de um material. A resistência de uma célula ao estresse e à tensão, seu tempo de relaxamento e sua elasticidade são propriedades que podem ser derivadas e comparadas a outros tipos de células. Quantificar as propriedades mecânicas de células cancerosas (malignas) versus normais (não malignas) permite que os pesquisadores descubram ainda mais os fundamentos biofísicos desta doença. Embora as propriedades mecânicas das células cancerosas sejam conhecidas por diferir consistentemente das propriedades mecânicas das células normais, um procedimento experimental padrão para deduzir essas propriedades das células em cultura está faltando.
Este trabalho descreve um procedimento para quantificar as propriedades mecânicas de células isoladas in vitro usando um ensaio de cisalhamento fluido. O princípio por trás deste ensaio envolve a aplicação de tensão de cisalhamento de fluido em uma única célula e o monitoramento óptico da deformação celular resultante ao longo do tempo. As propriedades mecânicas celulares são posteriormente caracterizadas usando a análise de correlação digital de imagem (DIC) e ajustando um modelo viscoelástico apropriado aos dados experimentais gerados a partir da análise DIC. De modo geral, o protocolo aqui delineado visa fornecer um método mais eficaz e direcionado para o diagnóstico de cânceres de difícil tratamento.
Introduction
O estudo das diferenças biofísicas entre células cancerosas e não cancerosas permite novas oportunidades diagnósticas e terapêuticas1. A compreensão de como as diferenças na biomecânica/mecanobiologia contribuem para a progressão tumoral e resistência ao tratamento revelará novos caminhos para a terapia-alvo e o diagnóstico precoce2.
Embora se saiba que as propriedades mecânicas das células cancerosas diferem das células normais (por exemplo, viscoelasticidade da membrana plasmática e do envelope nuclear)3,4,5, faltam métodos robustos e reprodutíveis para medir essas propriedades em células vivas6. O método de ensaio de cisalhamento é utilizado para quantificar as propriedades mecânicas de células, submetendo células isoladas à tensão de cisalhamento fluida e analisando suas respostas individuais e resistência à tensão aplicada 3,4,5,7,8,9. Embora vários métodos e técnicas tenham sido utilizados para caracterizar as propriedades mecânicas de células isoladas, estes tendem a afetar as propriedades do material celular por i) perfurar/danificar a membrana celular devido à profundidade de indentação, geometrias complexas da ponta ou enrijecimento do substrato associado à microscopia de força atômica (AFM)10,11, ii) induzir fotodano celular durante o aprisionamento óptico12, 13, ou iii) indução de estados complexos de estresse associados à aspiração por micropipetas14,15. Esses efeitos externos estão associados a incertezas significativas na acurácia das medidas de viscoelasticidade celular 6,16,17.
Para resolver essas limitações, o método de ensaio de cisalhamento descrito aqui fornece uma abordagem altamente controlável e simples para simular o fluxo fisiológico no corpo sem afetar as propriedades do material celular no processo. As tensões de cisalhamento de fluidos neste ensaio representam tensões mecânicas experimentadas pelas células do corpo, seja por fluidos dentro do interstício tumoral ou no sangue durante a circulação18,19,20. Além disso, esses estresses fluidos promovem vários comportamentos malignos nas células cancerosas, incluindo progressão, migração, metástase e morte celular 19,21,22,23, que variam entre células tumorigênicas e não tumorigênicas. Além disso, as características mecânicas alteradas das células cancerosas (isto é, muitas vezes são mais “moles” do que as células normais encontradas dentro do mesmo órgão) permitem que elas persistam em microambientes tumorais hostis, invadam tecidos normais circundantes e metastatizem para locais distantes24,25,26. Ao criar um ambiente pseudobiológico onde as células experimentam níveis fisiológicos de tensão de cisalhamento de fluidos, um processo que é fisiologicamente relevante e não destrutivo para a célula é alcançado. As respostas celulares a estas tensões de cisalhamento de fluidos aplicadas permitem caracterizar as propriedades mecânicas celulares.
Este trabalho fornece um protocolo de ensaio de cisalhamento para o estudo extensivo das propriedades mecânicas e comportamento de células cancerosas e não cancerosas sob estresse de cisalhamento aplicado. As células respondem às forças externas de forma elástica e viscosa, podendo, portanto, ser idealizadas como um material viscoelástico3. Esta técnica é categorizada em: (i) cultura celular de células isoladas dispersas, (ii) aplicação controlada de tensão de cisalhamento fluido, (iii) imagem in situ e observação do comportamento celular (incluindo resistência ao estresse e deformação), (iv) análise de deformação de células para determinar a extensão da deformação e (v) caracterização das propriedades viscoelásticas de células isoladas. Ao interrogar essas propriedades e comportamentos mecânicos, mecanobiologia celular complexa pode ser destilada para dados quantificáveis. Um protocolo delineando este método permite a catalogação e comparação entre vários tipos de células malignas e não malignas. A quantificação dessas diferenças tem o potencial de estabelecer biomarcadores diagnósticos e terapêuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de ensaio de cisalhamento, que inclui a criação de um ambiente pseudomecanobiológico para simular a interação das células com o microambiente mecânico circundante e suas respostas a estresses mecânicos, produziu um catálogo de propriedades mecânicas celulares, cujos padrões mostram atipias físicas conservadas entre linhagens de células cancerosas3,4,5,7,8<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem aos pesquisadores anteriores do grupo Soboyejo do Instituto Politécnico de Worcester que foram pioneiros nesta técnica: Drs. Yifang Cao, Jingjie Hu e Vanessa Uzonwanne. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional do Câncer (NIH/NCI K22 CA258410 a M.D.). As figuras foram criadas com BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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