Protocollo di saggio di taglio per la determinazione delle proprietà dei materiali a singola cellula
Summary
Questo protocollo delinea la quantificazione delle proprietà meccaniche di linee cellulari cancerose e non cancerose in vitro. Le differenze conservate nella meccanica delle cellule cancerose e normali possono agire come un biomarcatore che può avere implicazioni nella prognosi e nella diagnosi.
Abstract
La biomeccanica irregolare è un segno distintivo della biologia del cancro soggetta a studi approfonditi. Le proprietà meccaniche di una cella sono simili a quelle di un materiale. La resistenza di una cellula allo stress e alla tensione, il suo tempo di rilassamento e la sua elasticità sono tutte proprietà che possono essere derivate e confrontate con altri tipi di cellule. Quantificare le proprietà meccaniche delle cellule cancerose (maligne) rispetto alle cellule normali (non maligne) consente ai ricercatori di scoprire ulteriormente i fondamenti biofisici di questa malattia. Mentre le proprietà meccaniche delle cellule tumorali sono note per differire costantemente dalle proprietà meccaniche delle cellule normali, manca una procedura sperimentale standard per dedurre queste proprietà dalle cellule in coltura.
Questo articolo delinea una procedura per quantificare le proprietà meccaniche di singole cellule in vitro utilizzando un saggio a taglio fluido. Il principio alla base di questo test comporta l’applicazione dello sforzo di taglio del fluido su una singola cellula e il monitoraggio ottico della deformazione cellulare risultante nel tempo. Le proprietà meccaniche delle celle vengono successivamente caratterizzate utilizzando l’analisi di correlazione delle immagini digitali (DIC) e adattando un modello viscoelastico appropriato ai dati sperimentali generati dall’analisi DIC. Nel complesso, il protocollo qui delineato mira a fornire un metodo più efficace e mirato per la diagnosi di tumori difficili da trattare.
Introduction
Lo studio delle differenze biofisiche tra cellule cancerose e non cancerose consente nuove opportunità diagnostiche e terapeutiche1. Comprendere come le differenze nella biomeccanica / meccanobiologia contribuiscono alla progressione del tumore e alla resistenza al trattamento rivelerà nuove strade per la terapia mirata e la diagnosi precoce2.
Mentre è noto che le proprietà meccaniche delle cellule tumorali differiscono dalle cellule normali (ad esempio, viscoelasticità della membrana plasmatica e dell’involucro nucleare)3,4,5, mancano metodi robusti e riproducibili per misurare queste proprietà nelle cellule vive6. Il metodo del saggio di taglio viene utilizzato per quantificare le proprietà meccaniche delle cellule sottoponendo singole cellule a stress di taglio del fluido e analizzando le loro risposte individuali e la resistenza allo stress applicato 3,4,5,7,8,9. Sebbene siano stati utilizzati diversi metodi e tecniche per caratterizzare le proprietà meccaniche delle singole cellule, questi tendono a influenzare le proprietà del materiale cellulare i) perforando / danneggiando la membrana cellulare a causa della profondità di indentazione, geometrie complesse della punta o irrigidimento del substrato associato alla microscopia a forza atomica (AFM) 10,11, ii) inducendo fotodanno cellulare durante l’intrappolamento ottico 12, 13, o iii) inducendo stati di sollecitazione complessi associati all’aspirazione di micropipette14,15. Questi effetti esterni sono associati a significative incertezze nell’accuratezza delle misurazioni della viscoelasticità cellulare 6,16,17.
Per affrontare queste limitazioni, il metodo di analisi del taglio qui descritto fornisce un approccio altamente controllabile e semplice per simulare il flusso fisiologico nel corpo senza influire sulle proprietà del materiale cellulare nel processo. Le sollecitazioni di taglio dei fluidi in questo test rappresentano le sollecitazioni meccaniche sperimentate dalle cellule del corpo dai fluidi all’interno dell’interstizio tumorale o nel sangue durante la circolazione18,19,20. Inoltre, questi stress fluidi promuovono vari comportamenti maligni nelle cellule tumorali, tra cui progressione, migrazione, metastasi e morte cellulare 19,21,22,23 che variano tra cellule tumorigeniche e non tumorigeniche. Inoltre, le caratteristiche meccaniche alterate delle cellule tumorali (cioè, sono spesso “più morbide” delle cellule normali che si trovano all’interno dello stesso organo) consentono loro di persistere in microambienti tumorali ostili, invadere i tessuti normali circostanti e metastatizzare in siti distanti24,25,26. Creando un ambiente pseudo-biologico in cui le cellule sperimentano livelli fisiologici di stress da taglio dei fluidi, si ottiene un processo fisiologicamente rilevante e non distruttivo per la cellula. Le risposte cellulari a queste sollecitazioni di taglio dei fluidi applicate ci permettono di caratterizzare le proprietà meccaniche delle cellule.
Questo documento fornisce un protocollo di saggio di taglio per lo studio approfondito delle proprietà meccaniche e del comportamento delle cellule cancerose e non cancerose sotto sforzo di taglio applicato. Le cellule rispondono alle forze esterne in modo elastico e viscoso e possono quindi essere idealizzate come materiale viscoelastico3. Questa tecnica è classificata in: (i) coltura cellulare di singole cellule disperse, (ii) applicazione controllata dello stress di taglio del fluido, (iii) imaging in situ e osservazione del comportamento cellulare (compresa la resistenza allo stress e alla deformazione), (iv) analisi della deformazione delle cellule per determinare l’entità della deformazione e (v) caratterizzazione delle proprietà viscoelastiche delle singole cellule. Interrogando queste proprietà e comportamenti meccanici, la meccanobiologia cellulare complessa può essere distillata in dati quantificabili. Un protocollo che delinea questo metodo consente la catalogazione e il confronto tra vari tipi di cellule maligne e non maligne. Quantificare queste differenze ha il potenziale per stabilire biomarcatori diagnostici e terapeutici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo di saggio di taglio, che include la creazione di un ambiente pseudo-meccanobiologico per simulare l’interazione delle cellule con il microambiente meccanico circostante e le loro risposte alle sollecitazioni meccaniche, ha prodotto un catalogo di proprietà meccaniche cellulari, i cui modelli mostrano atipie fisiche conservate tra le linee cellulari cancerose 3,4,5,7,8 <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i precedenti ricercatori del gruppo Soboyejo del Worcester Polytechnic Institute che per primi hanno aperto la strada a questa tecnica: i dottori Yifang Cao, Jingjie Hu e Vanessa Uzonwanne. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 a M.D.). Le figure sono state create con BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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