Protocole de dosage de cisaillement pour la détermination des propriétés d’un matériau unicellulaire
Summary
Ce protocole décrit la quantification des propriétés mécaniques des lignées cellulaires cancéreuses et non cancéreuses in vitro. Les différences conservées dans la mécanique des cellules cancéreuses et normales peuvent agir comme un biomarqueur qui peut avoir des implications dans le pronostic et le diagnostic.
Abstract
La biomécanique irrégulière est une caractéristique de la biologie du cancer qui fait l’objet d’études approfondies. Les propriétés mécaniques d’une cellule sont similaires à celles d’un matériau. La résistance d’une cellule au stress et à la tension, son temps de relaxation et son élasticité sont autant de propriétés qui peuvent être dérivées et comparées à d’autres types de cellules. La quantification des propriétés mécaniques des cellules cancéreuses (malignes) par rapport aux cellules normales (non malignes) permet aux chercheurs de découvrir davantage les fondements biophysiques de cette maladie. Bien que les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses soient connues pour différer systématiquement des propriétés mécaniques des cellules normales, il n’existe pas de procédure expérimentale standard pour déduire ces propriétés à partir de cellules en culture.
Cet article décrit une procédure pour quantifier les propriétés mécaniques de cellules individuelles in vitro à l’aide d’un test de cisaillement fluide. Le principe derrière ce test consiste à appliquer une contrainte de cisaillement fluide sur une seule cellule et à surveiller optiquement la déformation cellulaire résultante au fil du temps. Les propriétés mécaniques des cellules sont ensuite caractérisées à l’aide de l’analyse de corrélation d’images numériques (DIC) et de l’ajustement d’un modèle viscoélastique approprié aux données expérimentales générées par l’analyse DIC. Dans l’ensemble, le protocole décrit ici vise à fournir une méthode plus efficace et ciblée pour le diagnostic des cancers difficiles à traiter.
Introduction
L’étude des différences biophysiques entre les cellules cancéreuses et non cancéreuses ouvre de nouvelles possibilités diagnostiques et thérapeutiques1. Comprendre comment les différences en biomécanique/mécanobiologie contribuent à la progression tumorale et à la résistance au traitement révélera de nouvelles voies pour la thérapie ciblée et le diagnostic précoce2.
Bien que l’on sache que les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses diffèrent de celles des cellules normales (p. ex. viscoélasticité de la membrane plasmique et de l’enveloppe nucléaire)3,4,5, il manque des méthodes robustes et reproductibles pour mesurer ces propriétés dans les cellules vivantes6. La méthode de dosage de cisaillement est utilisée pour quantifier les propriétés mécaniques des cellules en soumettant des cellules individuelles à une contrainte de cisaillement fluide et en analysant leurs réponses individuelles et leur résistance à la contrainte appliquée 3,4,5,7,8,9. Bien que plusieurs méthodes et techniques aient été utilisées pour caractériser les propriétés mécaniques de cellules individuelles, celles-ci ont tendance à affecter les propriétés des matériaux cellulaires en i) perforant/endommageant la membrane cellulaire en raison de la profondeur d’indentation, des géométries complexes de l’extrémité ou du raidissement du substrat associé à la microscopie à force atomique (AFM)10,11, ii) induisant des photodommages cellulaires pendant le piégeage optique 12, 13, ou iii) induisant des états de stress complexes associés à l’aspiration de micropipettes14,15. Ces effets externes sont associés à des incertitudes importantes dans la précision des mesures de viscoélasticité cellulaire 6,16,17.
Pour remédier à ces limitations, la méthode d’essai de cisaillement décrite ici fournit une approche simple et hautement contrôlable pour simuler le flux physiologique dans le corps sans affecter les propriétés du matériel cellulaire dans le processus. Les contraintes de cisaillement des fluides dans ce test représentent les contraintes mécaniques subies par les cellules du corps, soit par les fluides dans l’interstitium tumoral, soit dans le sang pendant la circulation18,19,20. En outre, ces stress fluides favorisent divers comportements malins dans les cellules cancéreuses, y compris la progression, la migration, les métastases et la mort cellulaire 19,21,22,23 qui varient entre les cellules tumorigènes et non tumorigènes. De plus, les caractéristiques mécaniques altérées des cellules cancéreuses (c’est-à-dire qu’elles sont souvent plus « molles » que les cellules normales trouvées dans le même organe) leur permettent de persister dans des microenvironnements tumoraux hostiles, d’envahir les tissus normaux environnants et de métastaser vers des sites éloignés24,25,26. En créant un environnement pseudo-biologique où les cellules subissent des niveaux physiologiques de stress de cisaillement des fluides, un processus physiologiquement pertinent et non destructeur pour la cellule est obtenu. Les réponses cellulaires à ces contraintes de cisaillement de fluide appliquées nous permettent de caractériser les propriétés mécaniques des cellules.
Cet article fournit un protocole d’essai de cisaillement pour l’étude approfondie des propriétés mécaniques et du comportement des cellules cancéreuses et non cancéreuses soumises à une contrainte de cisaillement appliquée. Les cellules répondent aux forces extérieures de manière élastique et visqueuse et peuvent donc être idéalisées comme un matériau viscoélastique3. Cette technique est classée en: (i) culture cellulaire de cellules individuelles dispersées, (ii) application contrôlée de contrainte de cisaillement fluide, (iii) imagerie in situ et observation du comportement cellulaire (y compris la résistance au stress et à la déformation), (iv) analyse de la déformation des cellules pour déterminer l’étendue de la déformation, et (v) caractérisation des propriétés viscoélastiques des cellules individuelles. En interrogeant ces propriétés mécaniques et ces comportements, la mécanobiologie cellulaire complexe peut être distillée en données quantifiables. Un protocole décrivant cette méthode permet le catalogage et la comparaison entre divers types de cellules malignes et non malignes. La quantification de ces différences a le potentiel d’établir des biomarqueurs diagnostiques et thérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode de dosage par cisaillement, qui comprend la mise en place d’un environnement pseudo-mécanobiologique pour simuler l’interaction des cellules avec le microenvironnement mécanique environnant et leurs réponses aux contraintes mécaniques, a produit un catalogue de propriétés mécaniques cellulaires, dont les modèles montrent des atypies physiques conservées parmi les lignées cellulaires cancéreuses 3,4,5,7,8 </s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les chercheurs précédents du groupe Soboyejo du Worcester Polytechnic Institute qui ont été les premiers à mettre au point cette technique: les Drs Yifang Cao, Jingjie Hu et Vanessa Uzonwanne. Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute (NIH / NCI K22 CA258410 to M.D.). Les figurines ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| CELL CULTURE | |||
| .25% Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x[-] sodium bicarbonate | Corning | 25-053-ci | For cellular detachment from substrate in cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 05-527-90 | |
| 35 mm Petri dishes | Corning | 430165 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon by Corning | 14-432-22 | |
| centrifuge | any | For sterile cell culture | |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x | Corning | 10-013-cv | Or any other media for culturing cells. DMEM was used for culturing U87 cells |
| gloves | any | For sterile cell culture | |
| Heracell Vios 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51033770 | For Incubation during cell culture |
| Hood | any | For sterile cell culture | |
| micropipette | any | For sterile cell culture | |
| micropipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Microscope | Leica/any | For sterile cell culture | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium PBS, 1x | Corning | 21-040-CM | |
| pipetman | any | For sterile cell culture | |
| pipette tips | any | For sterile cell culture | |
| Precision GP 10 liquid incubator | Thermo Scientific | TSGP02 | |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| T75 flask | Corning | 430641U | |
| SHEAR ASSAY | |||
| 100 mL beaker | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| DMEM | Corning | ||
| Flow chamber + rubber gasket | Glycotech | 31-001 | Circular Flow chamber Kit ( for 35 mm tissue culture dishes) |
| Hybrid Rheometer | HR-2 Discovery Hybrid Rheometer | For determination of shear fluid viscosity | |
| magnetic stir bar | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| magnetic stir plate | any | For creating DMEM + methyl cellulose viscous shear media | |
| methyl cellulose | any | To increase viscosity of DMEM in flow media | |
| Syringe Pump | KD Scientific Geminin 88 plus | 788088 | For programming fluid infusion and withdrawal |
| syringes, tubing, and connectors | For shear apparatus setup | ||
| SOFTWARE | |||
| ABAQUS software | Simulia | ||
| Digitial Image Correlation software | LaVision, Germany | DAVIS 10.1.2 | |
| Imaging software | Leica/any microscope software | ||
| MATLAB | MATLAB | MATLAB_R2020B |
References
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